大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第一課時

第一部分微生物的利用實驗1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離2、特點：結(jié)構(gòu)簡單,形體微小的單細胞、多細胞或沒有細胞結(jié)構(gòu)的低等生物.3、種類病毒原核生物：細菌、放線菌真菌：酵母菌原生動物

一、微生物及特點1、微生物：一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．二、關(guān)于細菌1、基本結(jié)構(gòu)2、分裂方式3、生殖類型4、變異類型5、在基因工程中的應(yīng)用1、細菌的外形大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見的三種細菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌2、細菌的營養(yǎng)類型根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)型:異養(yǎng)型:

光能自養(yǎng)型:光合細菌化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌寄生菌：腐生菌：3、細菌的革蘭氏染色

革蘭氏染色法是一種用于細菌的染色法。此法將細菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌1、

培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，提供微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)。2、培養(yǎng)基的成分三、細菌的培養(yǎng)碳源、氮源、生長因子、無機鹽、水細菌喜葷，霉菌喜素細菌培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母提取液、氯化鈉酸堿度：中性偏堿霉菌培養(yǎng)基：無機物或者添加蔗糖的麥芽汁酸堿度：中性偏酸3、培養(yǎng)基的類型a.按照培養(yǎng)基的形態(tài)固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：分離細菌，保留菌種等培養(yǎng)細菌液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長固體培養(yǎng)基：菌落單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。b.按培養(yǎng)基成分合成培養(yǎng)基：成分明確天然培養(yǎng)基：成分不明確c.按培養(yǎng)基功能1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：含有一般細菌生長的基本營養(yǎng)物質(zhì)。2、營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分上添加某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)，如血清或者生長因子，用以培養(yǎng)對營養(yǎng)要求高的微生物。50mL液體LB培養(yǎng)基：蛋白胨0.5,酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，水50mL(固體培養(yǎng)基再加1g瓊脂)3、選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。4、鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或者化學(xué)藥品，用于鑒別不同種類的微生物。如：尿素固體培養(yǎng)基可以分離以尿素為氮源的微生物如：伊紅和美藍與大腸桿菌代謝產(chǎn)物結(jié)合可以使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，可以用來鑒別大腸桿菌。四：無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。（１）消毒定義：2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：消滅病原微生物的過程。是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括所有細菌的繁殖體、芽胞、孢子），達到完全無菌的過程。3、常用消毒方法1、對接種室、接種箱或者超凈工作臺可用紫外線進行物理消毒,然后用酒精進一步消毒2、實驗操作者的雙手使用酒精進行消毒。1、灼燒滅菌滅菌的方法：4.常用的滅菌的方法2、高壓蒸汽滅菌：壓力：1kg/cm2溫度：121℃時間：15min.培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、移液管、槍頭、三角刮刀、接種環(huán)、無菌水、培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌不會破壞培養(yǎng)基的成分。1.無菌技術(shù)有什么好處？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手1、避免實驗室培養(yǎng)物被雜菌污染2、避免操作者自身被微生物感染。（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考：四、細菌的分離分離方法:劃線分離法、涂布分離法劃線分離法：方法簡單涂布分離法：單菌落更容易分開，但操作復(fù)雜分離目的：得到單菌落是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一平板劃線的操作不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。1.旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；2.是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。注意事項:1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h1、上述操作過程中，接種環(huán)有哪些灼燒過程？思考：2、各次灼燒的目的分別是什么？3、劃線結(jié)束后，接種環(huán)還需要灼燒嗎？第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；操作中每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，保證使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端。1、接種前灼燒2、操作過程中每次劃線前灼燒需要。殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。4.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。5.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單菌落。2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.五、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗操作1、培養(yǎng)基的配置與滅菌

取2個250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細菌的擴大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進入

2、倒平板

滅菌后的培養(yǎng)基在無菌操作臺上倒入4個培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面注意事項：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌操作臺用超凈紫外燈和過濾風(fēng)滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.3、大腸桿菌的擴大培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時。注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.4、劃線分離5、大腸桿菌分離后保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學(xué)和進一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。3.進行恒溫培養(yǎng)時為什么要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達不到分離目的。4.實驗完成后,接種過細菌的器皿應(yīng)如何處理?所有接觸過菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌,如何保證不被普通的大腸桿菌所污染?轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒不是細菌中原有的，而是經(jīng)過改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基對菌體進行培養(yǎng)。【課堂練習(xí)】例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）

A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的無機物只提供無機鹽

D.無機氮源也能提供能量D例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是（）A.防止雜菌污染B.接種前菌種要進行滅菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前B編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入

.自養(yǎng)型微生物

含碳有機物

（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)