第十二章 植物種植資源的離體保存

植物種質(zhì)資源

的離體保存第十二章知識要求了解植物種質(zhì)離體保存的類型與特點；了解超低溫保存的特點與方法；掌握植物種質(zhì)低溫保存的基本操作技術(shù)。植物種質(zhì)資源保存具體方法很多，大體可分為兩大類。一類是原境保存，為此建立自然保護區(qū)、天然公園或就地保護處于危險或受威脅的植物；另一類是異境保存，為此需要建立各種基因庫，如種子園、種植園等田間基因庫及種子庫、花粉庫等離體基因庫。野外保存植物種質(zhì)資源需要大量的土地和人力資源，成本高，且易遭受各種自然災(zāi)害的侵襲。種子庫只能保存正常型種子，對于頑拗型、脫水敏感的種子和有性繁殖困難的植物則無能為力，而且種子庫僅能保存基因，而不能保存特定的基因型材料。自1975年Henshaw和Morel首次提出離體保存(conservationinvitro)植物種質(zhì)的策略以來，該項技術(shù)受到植物界的極度重視。植物種質(zhì)離體保存：是指對離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細胞或原生質(zhì)等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理使之保存，在需要時可重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。意義：所占空間少，節(jié)省大量的人力、物力和土地；便于種質(zhì)資源的交流利用；需要時，可以用離體培養(yǎng)方法很快大量繁殖；避免自然災(zāi)害引起的種質(zhì)丟失。缺點：對于限制或延緩生長的處理，需定期轉(zhuǎn)移，連續(xù)繼代培養(yǎng)；易受微生物污染或發(fā)生人為差錯；多次繼代培養(yǎng)有可能造成遺傳性變異及材料和分化和再生能力的降低。超低溫保存可在一定程度上避免這些問題。常用的離體保存方法有緩慢生長保存(slowgrowthconservation)和超低溫保存(cryopreservation)。前者適合中短期保存，后者用于長期保存。第一節(jié)緩慢生長保存緩慢生長保存是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，抑制保存材料生長，實現(xiàn)延長繼代時間，減少操作和節(jié)省勞力的保存方法。影響離體保存的因素有保存時的光照、溫度、濕度、季節(jié)變化，培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，種質(zhì)資源的地理分布和生態(tài)類型等，可以根據(jù)具體材料采取不同的方法來延緩其生長。1．降低培養(yǎng)溫度降低培養(yǎng)溫度是植物組織培養(yǎng)物緩慢生長保存最常用的方法。葡萄和草莓莖尖培養(yǎng)物分別在9℃和4℃下連續(xù)保存多年，每年僅需繼代一次。梨試管苗在4℃下，每2年繼代一次，保存后，材料田間生長正常。芋頭莖培養(yǎng)物在9℃，黑暗條件下保存3年，仍有100%的存活率。正確選擇適宜低溫是保存后高存活率的關(guān)鍵。2．培養(yǎng)基中添加生長調(diào)節(jié)物質(zhì)常規(guī)組織培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中添加生長素或細胞分裂素以促進外植體的生長和發(fā)育。而試管苗種質(zhì)保存添加的則是生長延緩劑或生長抑制劑來抑制保存材料的生長，延長其繼代周期。離體保存常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有ABA(脫落酸)、CCC(矮壯素)、PP333(多效唑)、B9(比久)、MH(青鮮素)等。ABA對草莓試管苗芽增殖的抑制作用隨ABA使用濃度的增加而明顯增強，且均存在顯著性差異。在草莓試管苗的離體保存中，多效唑?qū)Σ葺嚬苊缪康姆只忻黠@的促進作用，對草莓試管苗芽的伸長具有明顯的抑制作用。

3．提高培養(yǎng)基滲透壓提高培養(yǎng)基的滲透壓可抑制培養(yǎng)材料的生長。最常用的方法是在培養(yǎng)基中加入甘露醇、醇等。這類化合物是惰性物質(zhì)，不易被外植體吸收，抑制外植體生長的作用持久。其作用機理是提高培養(yǎng)基的滲透勢負值，造成水分逆境，降低細胞擴大生長所必需的膨壓，使細胞吸水困難，減弱新陳代謝，延緩細胞生長，同時細胞壁酶的活性受到抑制，生長受阻，減少了養(yǎng)分消耗。4．適宜的光照強度光因子對植物的光合作用和生長有著重要的影響。調(diào)節(jié)光照強度以達到最佳的保存效果也是種質(zhì)保存經(jīng)常使用的方法之一。在較弱光照條件下，培養(yǎng)材料由于光合作用弱，生長緩慢而利于保存。5．合適的包扎物試管的包扎物也對保存材料的生長有影響，主要表現(xiàn)在不同的封口材料對試管中氣體成分及其含量等的變化，培養(yǎng)基的風(fēng)干、污染等有不同程度的影響。因此，選擇合適的包扎物對保存效果的影響很大。辛淑英（1989）在甘薯種質(zhì)的保存研究中發(fā)現(xiàn)，以鋁箔封口保存效果最佳，保持濕度效果好，還可以防止污染，而使用棉塞時間過長容易造成污染;使用橡皮塞容易造成缺氧，使材料死亡。6．培養(yǎng)基的營養(yǎng)控制植物生長發(fā)育依賴外界養(yǎng)分的供給，如果養(yǎng)分供應(yīng)不足，植物生長緩慢，植株矮小。因此采用降低培養(yǎng)基中的養(yǎng)分水平也可有效地抑制細胞生長，達到保存的目的。如菠蘿種質(zhì)在不添加任何生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中保存12個月后存活率為92.2%，小苗的平均生長量只有1cm左右；保存苗轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，很快恢復(fù)生長并分化出叢生芽，在同一培養(yǎng)基中保存18個月后仍有85.7%的存活。7．降低培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度通過降低培養(yǎng)材料周圍的大氣壓力或氧含量來保存植物組織培養(yǎng)材料，這一想法最早是由Caplin（1959）提出的。近10年這方面的研究比較少。而權(quán)銀等（1989）在柑橘種質(zhì)離體保存中對不同封口材料的比較研究表明，封口材料以其透氣性能影響試管內(nèi)氣體成分，從而影響保存效果。第二節(jié)超低溫保存一、超低溫保存概述通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫。超低溫冷凍保存一般以液氮為冷源，使溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下，活細胞內(nèi)的新陳代謝和生長活動幾乎完全停止，處于生理停頓狀態(tài)，因而可使植物材料在該溫度下不會發(fā)生遺傳性狀的改變，但細胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能可保存。超低溫保存技術(shù)可極大地延長儲存材料的壽命；避免細胞和組織的染色體數(shù)目因長期繼代而發(fā)生的變異；避免了離體材料在長期無性繁殖過程中可能造成的退化和病蟲侵害；可有效、安全地長期保存那些珍貴稀有的種質(zhì)。二、超低溫保存的研究概況1.超低溫保存技術(shù)的發(fā)展低溫干燥；減壓；超低溫自從1973年Nag等首次成功地超低溫保存了胡蘿卜懸浮細胞以來，國內(nèi)外已對近200種植物材料進行了超低溫保存。2.用于離體超低溫保存的植物材料種子、胚、胚軸和體細胞胚保存常用干凍法莖尖和分生組織大多用玻璃化法或包埋脫水法3.超低溫保存的植物種類超低溫保存已涉及到不同的植物種類，如野生及人工創(chuàng)造的谷類、豆類、薯類、油類、糖類、纖維類、蔬菜類、果樹、樹木、藥用植物和藻類等。超低溫冷凍保存為什么沒有把細胞凍死？細胞冰凍結(jié)冰保護性脫水理論溶液的玻璃化理論三、植物超低溫凍存的細胞學(xué)基礎(chǔ)細胞冰凍結(jié)冰保護性脫水理論常溫下，細胞及其溶液處于滲透平衡的狀態(tài)，當(dāng)溫度降到冰點以下時，首先是細胞外溶液部分“凍結(jié)”出冰；胞外溶液的濃度升高，破壞了細胞內(nèi)外溶液的平衡，水分由胞內(nèi)通過細胞膜向外滲透，細胞收縮，細胞內(nèi)濃度提高；當(dāng)溫度不斷降低時，凍結(jié)和滲透過程不斷進行，這種過程稱為保護性脫水。當(dāng)復(fù)溫時，溫度升高，凍結(jié)的冰不斷融化，水分由胞外向胞內(nèi)滲透，使收縮的細胞膨脹，可能恢復(fù)原狀。精確控制上述過程，能使細胞在降溫、復(fù)溫、滲透過程中不被損傷而死亡。溶液的玻璃化理論溶液在降溫時，如果沒有均一晶核或晶核生長缺乏足夠的時間，就首先形成過冷溶液。繼續(xù)降溫，均一晶核形成。如果降溫速度不夠快，就形成尖銳的冰晶。降溫速度足夠快，均一晶核很少或幾乎沒有形成，或均一晶核生長缺乏足夠的時間，溶液就進入無定型的玻璃化狀態(tài)。它是一種透明的固態(tài)，與液態(tài)相比，分子沒有發(fā)生重排，因此與晶態(tài)不同。被稱為玻璃態(tài)，此時的溫度叫玻璃化形成溫度。在玻璃化形成過程中，既沒有溶液效應(yīng)對細胞的損傷，也沒有冰晶的形成對細胞造成的機械傷害。提高超低溫冷凍保存的措施由于植物細胞含水量比動物細胞高，冰凍保存難度大，如果直接將保存材料放入液氮中，組織和細胞由于細胞內(nèi)水分結(jié)冰，引起組織和細胞死亡，因而，超低溫保存的植物材料必須借助于冷凍防護劑(cryoprotectant)。冷凍防護劑防護機理：在水溶液中能強烈地結(jié)合水分子，水合作用的結(jié)果使溶液的黏稠度增加。當(dāng)溫度下降時，溶液冰點下降，即冰的結(jié)晶中心增長速度下降，使水的固化程度減弱。因而對于降低培養(yǎng)基冰點和植物組織、細胞冰點起重要作用。冷凍防護劑的使用提高了培養(yǎng)基滲透壓，導(dǎo)致細胞的輕微質(zhì)壁分離，相對提高了組織和細胞的抗寒力。常用的冷凍防護劑滲透型冷凍防護劑:多為小分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的結(jié)晶過程，達到保護的目的。包括二甲基亞砜（DMSO）（極易滲入細胞內(nèi)部，可防止細胞在冷凍和融冰時，引起過度脫水而遭受破壞）甘油甘露醇脯氨酸乙二醇丙二醇非滲透型冰凍保護劑:是聚合分子物質(zhì)，能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，從而起到保護作用。此類冰凍保護劑對快速、慢速冷卻均有保護效果。常見的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingyl

pyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羥乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)四、超低溫保存的方法超低溫保存的基本操作程序為：選擇適宜年齡和生長狀態(tài)的冷凍材料；對生物材料進行預(yù)處理，提高分裂細胞的比例和減少細胞內(nèi)自由水的含量，使材料達到最適生理狀態(tài)；將材料裝入試管或其他保存容器中，放入冰浴中；在冰浴條件下加入0℃預(yù)冷的冷凍保護劑，冰浴放置30～45min；采用不同的降溫冰凍方式進行冷凍，直至最后放入液氮中，并在液氮中停留至少1h；保存后的化凍，一般采取在37～40℃溫水浴中快速化凍；材料化凍后的活力鑒定，進行再培養(yǎng)，觀察恢復(fù)生長的速度及植株的再生能力，分析凍后材料或再生植株的遺傳性狀。1.材料的選擇和預(yù)處理由于植物的基因型、抗凍性以及器官、組織和細胞的年齡、生理狀態(tài)等因素對超低溫保存的效果有較大的影響。一般來說，體積小、細胞質(zhì)稠密、無液泡、薄壁的小分生細胞的存活率高于含大量液泡的大細胞；莖尖生長點、愈傷組織等培養(yǎng)物，解凍后只有具有上述特征的細胞才能存活。而較大的植物材料，如莖尖、胚或試管苗等，由于高度液泡化的細胞易受損傷，冷凍后只有分生細胞能夠重新生長。為了使保存材料達到超低溫保存所要求的生理特性，還要對材料進行預(yù)處理，總的原則是提高細胞分裂與分化的同步化，減少細胞內(nèi)自由水的含量，增強細胞抗寒力。目前主要有3種預(yù)處理方式：（1）低溫鍛煉激活植物體內(nèi)抗寒機制（2）繼代培養(yǎng)增加有絲分裂細胞數(shù)目（3）預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中加冷凍保護劑或誘導(dǎo)抗寒力物質(zhì)2.冰凍方法降溫冰凍方法是影響超低溫保存效果的關(guān)鍵因素之一。（1）快速冰凍法將材料從0℃或預(yù)處理溫度直接投入液氮，其降溫速度在1000℃/min以上。這個過程可以使細胞內(nèi)的水分子還未來得及形成結(jié)晶中心就降到了-196℃的安全溫度，從而避免了細胞內(nèi)結(jié)冰的危險。此法適用于那些高度脫水的材料，如種子等。（2）慢速冰凍法采用逐步降溫的方法，以0.5～2℃/min的降溫速度，從0降到-30℃，-35或-40℃，隨即投入液氮，或者以此降溫速度連續(xù)降溫到-196℃。逐步降溫過程可以使細胞內(nèi)水分有充足的時間不斷流到細胞外結(jié)冰，從而使細胞內(nèi)水分含量減少到最低限度，達到良好的脫水效果，避免細胞內(nèi)結(jié)冰。這種方法適合于液泡化程度較高的植物材料，如懸浮細胞、原生質(zhì)體等。（3）分步冰凍法此法將快速和慢速2種冰凍方法結(jié)合起來。首先用較慢的速度（0.5～4℃/min）使植物材料從0℃降至一定的預(yù)冷溫度（一般為-40℃）并停留一段時間（一般10min左右），使細胞進行適當(dāng)?shù)谋Ｗo性脫水，然后再浸入液氮冷凍。（4）逐級冰凍法植物材料經(jīng)過冷凍保護劑0℃預(yù)處理后，逐級通過-10，-15，-25，-35，-40℃等，每個溫度停留10min左右，然后浸入液氮。（5）干燥冰凍法將樣品在含高濃度滲透性化合物（如甘油、糖類物質(zhì)等）培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間，或者經(jīng)硅膠、無菌空氣干燥脫水?dāng)?shù)小時，或者用褐藻酸鈣液泡包裹樣品，無菌風(fēng)進一步干燥，然后直接投入液氮；或者用冷凍保護劑處理后吸除表面水分，密封于金箔中進行慢凍。只要脫水足夠，細胞內(nèi)溶液濃度即可達到較高水平因而易進入玻璃化狀態(tài)。這種方法對某些植物的愈傷組織、體細胞胚、胚軸、胚、花粉、莖尖及試管苗等較合適，但對大多數(shù)對脫水敏感的材料不適用。（6）脫水冰凍法將植物材料先用含有甘油和糖類的冷凍保護劑進行滲透脫水，再置于-20～-30℃的冷藏庫內(nèi)凍結(jié)脫水，然后立即投入液氮中迅速冷凍。（7）玻璃化法在投入液氮前，使用高濃度的冰凍保護劑，或稱之為玻璃化液，在25℃或4℃下處理一段時間（一般10～60min）。玻璃化法的主要程序為：①選擇適宜的材料；②材料的預(yù)培養(yǎng)；③裝載液處理；④在0℃或25℃下用玻璃化液（PVS2）脫水；⑤投入液氮保存；⑥保存后快速化凍；⑦去除玻璃化液；⑧材料的恢復(fù)培養(yǎng)。（8）包埋脫水法包埋脫水法是參照人工種子技術(shù)，結(jié)合低溫保存的需要，將包裹和脫水結(jié)合起來，應(yīng)用于超低溫保存中。包埋脫水法最早出現(xiàn)在法國學(xué)者保存馬鈴薯莖尖的研究中。（9）包埋玻璃化法為了克服玻璃化法和包埋脫水法的缺點，有人將兩者的優(yōu)點結(jié)合起來，建立了包埋玻璃化法。需要指出的是，盡管各種冷凍方法各有自己的優(yōu)缺點，但目前為止還沒有一種方法普遍適用于所有的植物材料，所以必須根據(jù)不同材料來確定冷凍方法。

3.化凍和洗滌目前，多數(shù)研究采用快速化凍的方式，即將保存后的外植體材料在25～40℃的水浴中化凍1～2min，材料迅速通過冰晶生長區(qū)（-60～-40℃)，從而避免了細胞再次結(jié)冰而造成的傷害。在一些研究中，采用室溫流動空氣、自來水沖洗等進行材料化凍也取得了較好的效果。化凍后的材料需立即進行洗滌，以除去材料組織中高濃度的冷凍保護劑，避免影響材料恢復(fù)和繼續(xù)生長。最常用的洗滌方法是用含濃度為1.2mol/L蔗糖的基本培養(yǎng)基25℃下處理10min，也有用濃度為1.5～2.0mol/L的山梨醇的培養(yǎng)液進行保護劑成分的洗滌。4.活性檢測和恢復(fù)培養(yǎng)凍后存活率的快速鑒定通常采用FAD熒光雙醋酸法、TTC(氯化三苯四氮唑)還原法、Evans(伊凡藍)法等。這些方法均以細胞內(nèi)某些酶的活力檢測為標準，不能完全表征細胞與組織的再生能力。因此凍存后材料的活力不能僅以此衡量。此外，染色法都要破壞材料來檢測。由此，出現(xiàn)了一種不破壞材料，通過檢測材料產(chǎn)生揮發(fā)性碳氫化合物如乙烯、乙烷等含量的方法。凍后再培養(yǎng)雖然費時較長，卻是檢驗材料存活率的最可靠方法。通常將莖尖洗滌后，接種到恢復(fù)培養(yǎng)基7-15d后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)，1周統(tǒng)計存活率，1個月統(tǒng)計再生率?；謴?fù)培養(yǎng)時是否需要光照表現(xiàn)出物種差異。5.超低溫保存后的遺傳穩(wěn)定性種質(zhì)資源保存的最根本的目的是保持遺傳基因的穩(wěn)定，控制遺傳性狀不發(fā)生變化。因此超低溫凍存后材料的遺傳特性的檢測是十分必要的。Liuetal(2004)研究了超低溫保存后蘋果莖尖的形態(tài)學(xué)特征，并進行了同工酶分析及RAPD和AFLP分析，發(fā)現(xiàn)凍存材料化凍后和對照材料具有相同的再生能力，在形態(tài)學(xué)上沒有差異，可溶性蛋白和POD酶也沒有差異。進一步用RAPD和AFLP研究DNA水平的變化，也未發(fā)現(xiàn)兩者有DNA水平的差異。張玉進等發(fā)現(xiàn)玻璃化法凍存后魔芋的遺傳特性未發(fā)生改變。其他的研究結(jié)果也表明超低溫保存后材料未發(fā)生染色體或DNA水平的變化，說明了超低溫保存在保持種質(zhì)資源遺傳穩(wěn)定性方面具有其他保存方法所不具有的優(yōu)越性。

五、影響超低溫保存效果的主要因素1.材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性及器官、組織和細胞的年齡以及生理狀態(tài)。不同基因型的植物離體材料對超低溫凍存的反應(yīng)各不相同。2.預(yù)培養(yǎng)和低溫鍛煉預(yù)處理對于調(diào)整植物離體材料的生理狀態(tài)非常有效。通過預(yù)處理的植物材料，減少了細胞內(nèi)自由水的含量，使細胞能經(jīng)受低溫脅迫，減少或避免了冷凍傷害，可大大提高材料的抗凍力。3.冰凍保護劑的應(yīng)用一般的生物體在沒有添加冰凍保護劑的情況下經(jīng)歷低溫后是很難存活下來的。所以，生物體的低溫保存離不開冰凍保護劑4.化凍方法液泡小、含水量少的細胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法。液泡大、含水量高的細胞則一般需要采用慢速化凍法。5.再培養(yǎng)經(jīng)凍存的材料會不可避免地受到不同程度的傷害。為了減少再培養(yǎng)中的光抑制，利于離體材料恢復(fù)生長，凍存的材料一般在黑暗或弱光下培養(yǎng)1～2周，再轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)。再培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基一般是與保存前的相同，但有時需將大量元素或瓊脂含量減半，有時則在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生長的恢復(fù)。六、植物種質(zhì)資源超低溫保存的展望建立在離體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上的超低溫保存技術(shù)，在種質(zhì)資源保存中獨具潛力與優(yōu)勢。超低溫保存的材料涉及原生質(zhì)體、懸浮細胞、愈傷組織、體細胞胚、花粉胚、花粉、花藥、種子、莖尖分生組織、芽、莖段，甚至植株幼苗等。同時，超低溫保存技術(shù)在瀕危植物資源的保存中發(fā)揮了巨大作用。植物種質(zhì)超低溫保存技術(shù)具有傳統(tǒng)