流感病毒的致病機制、檢測方法和防治,醫(yī)學檢驗論文

流感病毒的致病機制、檢測方法和防治,醫(yī)學檢驗論文摘要：流行性感冒是一種由流感病毒引發(fā)的急性呼吸道傳染病，春、秋季節(jié)高發(fā)。由于流感病毒基因容易發(fā)生變異，病毒基因重組經(jīng)過復雜且無法預測，易突變成新的流感病毒變異株。除此之外，禽流感病毒〔AIV〕頻繁地從禽類跨物種直接感染人類，甚至曾經(jīng)引發(fā)全球范圍內(nèi)的大流行，為人類健康和公共衛(wèi)生安全埋下了宏大隱患。近年來，針對流感病毒的研究已獲得了眾多成果。文章從流感病毒的病原學、臨床表現(xiàn)與傳播方式、致病機制、檢測方式方法和治療方案等方面進行綜述。本文關鍵詞語：流感病毒;病原學;臨床表現(xiàn)與傳播方式;致病機制;檢測方式方法;治療方案;Abstract：Influenzaisanacuterespiratoryinfectiousdiseasecausedbyinfluenzaviruses,whichoccursfrequentlyinspringandautumn.Becauseofthegenevariationsandunpredictablerecombinationofinfluenzaviruses,itiseasytomutatetoproduceanewtypeofinfluenzavirusvariant.Inaddition,avianinfluenzaviruses(AIV)frequentlyinfecthumandirectlyfrompoultrycrossspecies,evenhavecausedaglobalpandemic,layingahiddendangerforhumanhealthandpublichealthsafety.Intherecentyears,muchprogresshasbeenmadeintheresearchofinfluenzaviruses.Thisreviewfocusesontheetiology,clinicalsymptomsandmodeoftransmission,pathogenicmechanism,detectionmethodsandtreatmentplanofinfluenzaviruses.Keyword：Influenzavirus;Etiology;Clinicalsymptomandmodeoftransmission;Pathogenicmechanism;Detectionmethod;Treatmentplan;流行性感冒是由流感病毒引發(fā)的急性呼吸道傳染病，春、秋季節(jié)高發(fā)，亞太地區(qū)高發(fā)[1]。1、流感病毒病原學流感病毒是直徑為80～120nm的球形或絲狀的單股負鏈分節(jié)段RNA病毒，屬正黏病毒科，其基因組包括8個獨立的RNA片段[2]，第1、2、3片段分別編碼PB1、PB2、PA，介入病毒遺傳物質(zhì)的復制和轉(zhuǎn)錄；第4片段編碼血凝素〔hemagglutinin,HA〕，介導受體結(jié)合和膜融合，是流感病毒的主要免疫原性蛋白；第5片段編碼核蛋白〔nucleoprotein,NP),NP與病毒組RNA及PB1、PB2、PA相連構成核糖核蛋白〔ribonucleoprotein,RNP〕，介入病毒的裝配和RNA的合成；第6片段編碼神經(jīng)氨酸酶〔neuraminidase,NA),NA能夠去除細胞外表的唾液酸，防止病毒粒子聚集，促進病毒的釋放；第7片段編碼基質(zhì)蛋白〔matrixprotein,MP),MP中的M1能維持病毒的形態(tài)，是病毒的主要構造蛋白，其與NP是病毒分型的根據(jù)；第8片段編碼非構造蛋白NS1和NEP/NS2,NS1能拮抗宿主的非特異性免疫，并抑制干擾素產(chǎn)生，NEP/NS2可促進病毒RNA的表示出，并介入其轉(zhuǎn)運經(jīng)過。根據(jù)NP和MP的抗原性差異，流感病毒能夠分為甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒及丁型流感病毒4類?！?〕甲型流感病毒。該病毒宿主諸多、血清型復雜，能夠通過基因重組和適應性突變獲得跨宿主傳播能力。人類對甲型流感病毒缺乏持久的免疫力，所以所有年齡段人群均普遍易感，甲型流感病毒是引起流行性感冒大流行的最主要病原體[3]。甲型流感病毒外表蛋白HA有16個亞型，NA有9個亞型，病毒可根據(jù)HA和NA的組合情況進一步分類為若干亞型。由于HA和NA抗原構造能通過基因位點的突變或基因重組使病毒變異，因而甲型流感病毒屬中的禽流感病毒〔avianinfluenzavirus,AIV〕能夠突破種屬屏障感染人類，當前能夠感染人類的AIV有：H5N1、H5N6、H6N1、H7N7、H7N9等亞型[4]。AIV曾爆發(fā)式大流行，牽涉多個國家和地區(qū)，如2018年爆發(fā)的甲型H1N1流感病毒[4]?！?〕乙型流感病毒。該病毒多在小范圍內(nèi)流行傳播，當前無亞型之分，引起人類感染的主要是乙型Yamagata系或乙型Victoria系。亞太地區(qū)的15個國家在每個月的流行性感冒確診病例中，乙型流感病毒確實診率為0～92%[1]，與甲型流感病毒不同，兒童、老年人等特定人群易感乙型流感病毒，并易引發(fā)并發(fā)癥，對社會造成的負擔甚至超過甲型流感病毒[5]?！?〕丙型流感病毒。該病毒檢出率較低，通常導致輕度感染，對公共衛(wèi)生和健康影響較小?！?〕丁型流感病毒。該病毒是近期幾年才被發(fā)現(xiàn)的，主要感染牛、羊、豬等[6]。2、流行性感冒的臨床表現(xiàn)與病毒的傳播途徑流行性感冒的臨床表現(xiàn)主要為：咳嗽、鼻塞、頭痛、咽喉痛、食欲減退、胸骨后不適、肌肉酸痛等全身性不適。甲型流感病毒感染患者常伴有發(fā)熱，體溫可達39℃，甚至超過39℃。感染乙型流感病毒的兒童多表現(xiàn)為嘔吐、腹痛、腹瀉。無并發(fā)癥的流感病毒感染患者多為自限性病程，發(fā)病1周左右高熱逐步消退，全身異常感覺和狀態(tài)好轉(zhuǎn)。在兒童、孕婦、老年人和免疫缺陷群體等高危人群中，流感病毒可誘發(fā)嚴重的病毒性肺炎，導致多器官衰竭或基礎疾病惡化。因兒童呼吸道保衛(wèi)屏障發(fā)育不完善，更易引起咽喉炎、支氣管炎或肺炎等異常感覺和狀態(tài)，有26.5%的季節(jié)性流行性感冒住院患兒可并發(fā)肺炎[7]。老年人由于常伴有呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等原發(fā)疾病，感染病毒后病情較重且進展快，肺炎發(fā)生率高于青壯年人群，且易誘發(fā)心力衰竭、急性心肌梗死或并發(fā)腦炎等疾病，在65歲以上老年人群中，流行性感冒相關死亡率與年齡呈正相關[8]。女性在懷孕期間呼吸系統(tǒng)功能明顯改變，且免疫系統(tǒng)會介導細胞免疫向體液免疫轉(zhuǎn)移，因而孕婦對于流感病毒的抵抗力更弱，感染后易發(fā)生肺炎、呼吸困難，甚至有流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎死宮內(nèi)等風險[9]。被流感病毒感染后，患者的呼吸道分泌物中存在大量的流感病毒顆粒，可在打噴嚏和咳嗽時通過飛沫傳播。除此之外，流感病毒可以通過口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或間接接觸傳播[10]。對人類造成嚴重影響的AIV的傳播方式主要是通過接觸被感染禽類及其排泄物等，尚未發(fā)現(xiàn)人傳人的現(xiàn)象[11]。由于病毒結(jié)合受體存在差異，甲型流感病毒通過人類呼吸道中的SA2-6唾液酸受體感染宿主，而AIV感染禽類則是通過結(jié)合禽類胃腸道上的SA2-3唾液酸受體[12]，因而AIV能否能實現(xiàn)宿主間的傳播，關鍵在于其受體結(jié)合能力。3、流感病毒的致病機制流感病毒外表的HA和NA均有助于流感病毒的傳播、增殖，且極易發(fā)生基因重組，加強病毒的致病性。HA能夠辨別宿主細胞外表的SA受體并與其結(jié)合，通過胞吞作用進入細胞內(nèi)，促進M2離子通道的構成，而M2可促進病毒粒子進入宿主細胞核進行復制。同時，NA有助于新構成的病毒顆粒被釋放，病毒即是以這種方式在細胞間傳播。HA還含有對B淋巴細胞產(chǎn)生中和抗體起關鍵作用的抗原決定簇，因而HA的表位是影響病毒突變和重組機制的主要決定因素，其高變異性使病毒能夠逃避宿主的免疫監(jiān)視[13]。HA能夠迅速活化蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC〕，有利于病毒的侵入復制，并通過PKCOt的活化和核蛋白輸出進一步激活絲裂原活化蛋白激酶〔mitogenactivatedproteinkinase,MAPK〕通路，使核輸出更為有效，進一步促進病毒的復制。除此之外，非構造蛋白NS1和NEP/NS2的存在為病毒在宿主體內(nèi)復制定植創(chuàng)造了基礎條件，華而不實NS1能對抗宿主天然免疫反響，抑制干擾素產(chǎn)生；NEP/NS2則介入拮抗宿主抗病毒反響。在免疫應答初期，細胞因子會幫助宿主抵抗病毒感染，但長期的持續(xù)感染會導致相關信號通路被激活，引起多種炎癥因子級聯(lián)放大，構成細胞因子風暴，進而導致急性肺損傷[14]。病毒的形式辨別受體〔patternrecognitionreceptor,PRR〕，包括Toll樣受體〔Tolllikereceptor,TLR〕、RIG-I樣受體〔RIG-Ilikereceptor,RLR〕和NOD樣受體〔NODlikereceptor,NLR〕等，是抑制重癥感染誘發(fā)免疫性病理損傷及研究非特異性免疫應答的重要靶點，流感病毒通過操縱這些信號分子能夠有效使被感染宿主致病。TLR是病原體的主要傳感器，TLR3介導病毒dsRNA的辨別，TLR4介導急性肺損傷，高遷移率族蛋白B1(highmobilitygroupproteinB1,HMGB1〕辨別TLR4后活化核因子B(nuclearfactorkappa-B,NF-B〕產(chǎn)生干擾素〔interferon,IFN〕，可導致重癥肺炎[15]。TLR7/8介導病毒ssRNA的辨別，激活NF-B，促進多種炎性細胞因子的分泌[16]。NLR能誘導產(chǎn)生多種細胞因子，但過度活化會導致免疫損傷，如NLRP3過度活化可導致非致命性流感病毒感染中的嚴重肺損傷[17]。除此之外，流感病毒能夠激活p53，抑制干擾素誘導的跨膜蛋白，維持病毒的傳染性，并可促進病毒繁衍[18]。4、流感病毒的檢測方式方法當前，臨床實驗室檢測流感病毒的方式方法主要為病毒分離培養(yǎng)、病毒抗原檢測、病毒核酸檢測等。4.1、病毒分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)是最傳統(tǒng)的病毒檢測方式方法。將患者樣本接種于細胞或胚胎中，繁衍7～10d，監(jiān)測細胞能否發(fā)生病變，然后通過特異性染色或免疫熒光顯微鏡等最終確認能否存在流感病毒[19]。離心細胞培養(yǎng)法〔shellviralculture,SVC〕是另一種病毒培養(yǎng)方式方法，與傳統(tǒng)的病毒分離方式方法相比更簡單、快速、靈敏，可在24～48h檢測到病毒[20]，特異性高，是病毒感染診斷的金標準，也是疫苗研制的基礎，但培養(yǎng)病毒耗時長、易發(fā)生支原體污染，難以知足大量樣本或大量病原體快速檢測的需求。4.2、抗原檢測常用的抗原檢測方式方法有直接免疫熒光法〔directimmunofluorescence,DFA〕和流感病毒快速診斷測試〔rapiddiagnosistestofinfluenza,RIDT〕。DFA是通過熒光直接標記流感病毒的特異性抗體，在熒光顯微鏡下觀察鼻咽拭子的呼吸道上皮細胞中有無特異性病毒抗原；RIDT是采用免疫層析法，用膠體金或乳膠顆粒標記流感病毒抗體，通過抗原抗體特異性結(jié)合反響，30min即可判讀結(jié)果[21]?？乖瓩z測的優(yōu)點是操作方便、檢測周期短、效率高，能知足短時間內(nèi)檢測大量樣本的需求；缺點是檢測敏感性和特異性不夠高，只能區(qū)分甲型和乙型流感病毒，無法區(qū)分病毒的亞型，且抗原抗體易發(fā)生非特異性結(jié)合。4.3、核酸檢測4.3.1、聚合酶鏈反響聚合酶鏈反響技術的快速發(fā)展讓傳染病診斷有了更廣闊的空間，相比抗原檢測，核酸檢測更為敏感，能夠在早期檢出臨床樣本中的病毒。當前用于人類流感病毒感染的檢測方式方法有：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響〔reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR〕、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術〔reversetranscriptionloopmediatedisothermalamplification,RT-LAMP〕、基于簡單擴增的檢測〔detectionbasedonsimpleamplification,SAMBA〕、依靠核酸序列的擴增〔amplificationofDNAdependentsequences,NASBA〕和微陣列技術等[20]。其優(yōu)點是檢測敏感性和特異性好，能夠精到準確鑒別未知流感病毒株的分型，適用于挑選和鑒定亞型流感病毒。缺點是僅限于對單一病原體型別進行診斷，檢測時間較長、操作復雜，對實驗室和操作人員要求較高，且結(jié)果易受基因突變、抑制劑和RNA降解影響。4.3.2、基因測序法測序是基因診斷的金標準，通過測序技術能夠準確、快速地獲取生物體的遺傳信息。ZHAO等[22]利用RT-PCR下一代測序〔nextgenerationsequencing,NGS〕診斷平臺對161份臨床樣本進行檢測，結(jié)果表示清楚該平臺能夠在核酸低濃度條件下實現(xiàn)與實時RT-PCR一樣的高靈敏度，并且能夠提供流感病毒基因組全譜，實現(xiàn)多重辨別和功能意義的同步鑒定。SEONG等[19]采用NGS深度測序技術，檢測了鼻咽拭子等臨床樣本，結(jié)果表示清楚該方式方法能有效地應用于調(diào)查致病性流行性感冒的分子特征。LEE等[23]在MiSeq測序器上開發(fā)了一種檢測試劑盒和軟件，對148份H3N2甲型流感病毒樣本進行測序，結(jié)果表示清楚該方式方法能有效控制高通量測序的樣本污染率，并比Sanger測序愈加高效。高通量測序法的優(yōu)點是檢測結(jié)果準確度高，能夠?qū)α鞲胁《具M行準確的基因檢測和分型，即便在發(fā)生基因突變的情況下也能實現(xiàn)，但檢測成本較高、周期長，難以知足快速檢測大量樣本的需求，樣本與樣本之間存在穿插污染的可能，易造成假陽性。4.4、其他檢測方式方法流感病毒的檢測方式方法多種多樣，芯片技術是華而不實之一。芯片技術起源于微機電系統(tǒng)，現(xiàn)已被用于多種病原體的檢測。SHEN等[24]開發(fā)了一種以HA、NA陣列為特征的微流控芯片，通過使用聚糖包被的磁珠和RT-PCR，實現(xiàn)流感病毒的快速檢測，并可在100min內(nèi)完成12種甲型流感病毒亞型的檢測。LU等[25]建立了一個磁控數(shù)字化微流控平臺，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測甲型H1N1病毒抗體，整個分析經(jīng)過可在40min內(nèi)完成，且靈敏度高，在快速診斷流感病毒方面具有很大的潛力。芯片技術反響效率高、檢測通量高、試劑消耗少，但設備昂貴，操作比擬復雜，只能檢測已經(jīng)知道的位點，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。5、流感病毒感染的治療及預防流感病毒外表的NA能促進成熟病毒顆粒脫落傳播，而神經(jīng)氨酸酶抑制劑〔neuraminidaseinhibitors,NAIS〕能夠與NA特異性結(jié)合，進而抑制病毒的傳播、釋放。奧司他韋能夠?qū)⒛c道中的酯酶轉(zhuǎn)為活性代謝物，進而干擾病毒的傳播，患者入院6h內(nèi)用藥，有助于縮短住院時間、改善生存率[26]。但假如患者入院時已經(jīng)出現(xiàn)了下呼吸道感染異常感覺和狀態(tài)，即便使用奧司他韋，也無法更好地改善異常感覺和狀態(tài)或降低病死率，但雷帕霉素和奧司他韋聯(lián)合使用，對已發(fā)生嚴重免疫損傷的患者有一定療效[27]，原因在于藥物可通過抑制ALRP3介導的信號通路，進一步抑制病毒復制和免疫過度，緩解肺損傷嚴重程度，降低患者死亡率。帕拉米韋作為唯一的靜脈注射類NAIS，療效要優(yōu)于其他NAIS，且對兒童和成人均有效，比口服奧司他韋能夠更有效地縮短退燒時間[28]，但可能會與其他NAIS互相耐藥，且對奧司他韋耐藥的患者療效不理想[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸與帕拉米韋聯(lián)合使用能增加藥物對NA的親和力，是解決耐藥性問題的突破口[30]。固然長期使用帕拉米韋會誘導流感病毒位點的突變，削弱病毒復制能力，但會導致患者對所有的NAIS耐藥，應慎重使用[31]。隨著對NAIS耐藥病例的日益增加，具有不同機制的新型抗病毒藥物被研發(fā)出來，如巴洛沙韋。巴洛沙韋是一種帽依靠性核酸內(nèi)切酶抑制劑，能夠抑制病毒本身mRNA的轉(zhuǎn)錄[32]。有研究結(jié)果顯示其不良反響發(fā)生率顯著低于奧司他韋[33]。每年全球范圍內(nèi)的流行性感冒病例中，有300萬～500萬例嚴重病例，與呼吸道疾病相關的死亡病例為29萬～65萬例[34]，接種疫苗還是當前最有效的防備手段?，F(xiàn)有的流感疫苗包括裂解疫苗、減毒活疫苗、全病毒滅活疫苗等。人用流感疫苗通常采用的是雞胚法，但其操作復雜、生產(chǎn)周期長，當前科學家積極研發(fā)了犬腎細胞〔Madin-Darbycaninekidney,MDCK〕、非洲綠猴腎細胞〔africangreenmonkeykidneycell,Vero〕和人胚胎成視網(wǎng)膜細胞〔humanembryonicretinoblasts,PER.C6〕等基于細胞培養(yǎng)的技術，用于流感疫苗的制備[35]。除了接種疫苗，在流行性感冒高發(fā)季節(jié)，建議采取佩戴口罩、勤洗手等防護措施，同時加強本身免疫力，注意保暖及空氣的流通。如出現(xiàn)感冒異常感覺和狀態(tài)，應注意休息，避免去人群密集場所造成病毒的二次傳播，有發(fā)熱現(xiàn)象應及時就醫(yī)。6、瞻望流感病毒每年均反復引發(fā)人類呼吸道疾病，給社會經(jīng)濟和人類健康造成了沉重的負擔[36]。當前預防和控制流行性感冒最為有效的措施就是接種疫苗。盡管公共衛(wèi)生組織建議6月齡以上的人群都應接種流感疫苗，尤其是兒童、老年人、孕婦等易感人群及免疫功能缺陷的群體，然而由于流感疫苗的接種主要基于自愿、自費和我們國家人口基數(shù)龐大、流感疫苗需每年接種等原因，很大程度上影響了我們國家疫苗的接種覆蓋率[37]。我們無法預測流行性感冒的發(fā)展趨勢，能否會出現(xiàn)新的亞型、能否會跨物種傳播、能否會造成新的大流行，所以仍需對流感病毒進行深切進入研究，積極研發(fā)更有效的疫苗和抗病毒藥物，積極開發(fā)更有效的檢測手段，盡量避免大流行的出現(xiàn)，確保公眾健康。以下為參考文獻[1]JENNINGSL,HUANGQS,BARRI,etal.LiteraturereviewoftheepidemiologyofinfluenzaBdiseasein15countriesintheAsia-Pacificregion[J].InfluenzaOtherRespirViruses,2021,12(3):383-411.[2]閆若潛，杜向.流感病毒基因組構造及其編碼蛋白研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2004,25(1):32-35.[3]房師松，王昕.甲型流感病毒宿主特異性與適應性進化[J].國際病毒學雜志，2022,26(6):426-430.[4]ZHANGR,CHENT,OUX,etal.Clinical,epidemiologicalandvirologicalcharacteristicsofthefirstdetectedhumancaseofavianinfluenzaA(H5N6)virus[J].InfectGenetEvol,2021,40:236-242.[5]TRAND,VAUDRYW,MOORED,etal.HospitalizationforinfluenzaAversusB[J].Pediatrics,2021,138(3):e20214643.[6]ZHAISL,ZHANGH,CHENSN,etal.InfluenzaDvirusinanimalspeciesinGuangdongprovince,southernChina[J].EmergInfectDis,2021,23(8):1392-1396.[7]鐘慧君，李慧錦，楊勇.87例流感合并肺炎支原體感染患兒臨床特征[J].中國感染控制雜志，2022,18(12):1154-1158.[8]LIS,LIUSS,ZHUAQ,etal.ThemortalityburdenofinfluenzainChina:asystematicreview[J].ZhonghuaYuFangYiXueZaZhi,2022,53(10):1049-1055.[9]LIUS,SHAJ,YUZ,etal.Avianinfluenzavirusinpregnancy[J].RevMedVirol,2021,26(4):268-284.[10]BELSERJA,LASHRR,GARGS,etal.Theeyeshaveit:influenzavirusinfectionbeyondtherespiratorytract[J].LancetInfectDis,2021,18(7):e220-e227.[11]PETERANDERLC,HEROLDS,SCHMOLDTC.Humaninfluenzavirusinfections[J].SeminRespirCritCareMed,2021,37(4):487-500.[12]DHARMAPALAND.Influenza[J].IndianJPediatr,2020,87:828-832.[13]WANGX,SUNQ,YEZ,etal.ComputationalapproachforpredictingtheconservedB-cellepitopesofhemagglutininH7subtypeinfluenzavirus[J].ExpTherMed,2021,12(4):2439-2446.[14]KIMKS,JUNGH,SHINIK,etal.Inductionofinterleukin-1beta(IL-1〕isacriticalcomponentoflunginflammationduringinfluenzaA(H1N1)virusinfection[J].JMedVirol,2021,87(7):1104-1112.[15]CARLINAF,PLUMMEREM,VIZCARRAEA,etal.AnIRF-3-,IRF-5-,andIRF-7-independentpathwayofdengueviralresistanceutilizesIRF-1tostimulatetypeⅠandⅡinterferonresponses[J].CellRep,202121(6):1600-1612.[16]HARADAK.Sclerosingandobstructivecholangiopathyinbiliaryatresia:mechanismsandasso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