高一生物格羅寶爾集成墻飾細(xì)胞凋亡

高一生物格羅寶爾集成墻飾細(xì)胞凋亡一.細(xì)胞凋亡的研究歷史1.

凋亡概念的形成和形態(tài)學(xué)的研究(1972）1972年Kerr等在英國(guó)癌癥雜志發(fā)表論文，首次提出細(xì)胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開(kāi)始。2．DNA的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與。(1987）3.蛋白質(zhì)水解酶活化的研究(1995)4.細(xì)胞膜的變化(1997)5.線粒體的變化和分子生物學(xué)的研究(1998-)1)相關(guān)基因及調(diào)控2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3）各種分子及其相互作用及相互關(guān)系4）疾病機(jī)制的闡明，以及新療法的探索及問(wèn)世。

二.概念

細(xì)胞凋亡是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自殺，由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過(guò)程。細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個(gè)功能性概念，強(qiáng)調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能，一般指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍單個(gè)細(xì)胞丟失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細(xì)胞體積減少、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器無(wú)明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無(wú)后果不引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義生理死亡方式病理死亡方式三.細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征形態(tài)學(xué)變化生物化學(xué)變化

DNA片段化大分子的合成

tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的積累并達(dá)到較高的水平。

細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征（1）凋亡的起始；微絨毛的消失，細(xì)胞間接觸的消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)中，線拉體大體完整，染色質(zhì)固縮，（2）細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，（3）凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍。（4）凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。

細(xì)胞凋亡DNA的片段化演示文稿1

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后

等格羅寶爾集成墻飾亞叀夻格羅寶爾集成墻飾四.細(xì)胞凋亡的過(guò)程及機(jī)理

接受凋亡信號(hào)凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)細(xì)胞凋亡的兩條通路：膜受體通路、線粒體通路膜受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白：（死亡結(jié)構(gòu)域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TNF+TNFRI（死亡結(jié)構(gòu)域）+TRADD—細(xì)胞凋亡FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FasL+Fas（死亡結(jié)構(gòu)域）

+FADD—細(xì)胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(一)細(xì)胞凋亡的膜受體通路FASL+FAS+FADD

凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物（DISC）胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個(gè)復(fù)合物上細(xì)胞有足夠caspase8細(xì)胞caspase8濃度不夠死亡受體活化，切割BidtBid從胞質(zhì)到線粒體細(xì)胞凋亡

CtyC釋放線粒體與細(xì)胞凋亡線粒體參與細(xì)胞凋亡或壞死的途徑釋放caspase活化因子細(xì)胞色素C：細(xì)胞色素C+Apaf-1+caspase9—凋亡體AIF（凋亡誘導(dǎo)因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子

(二)線粒體通路

五.凋亡的效應(yīng)分子

細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制雖然還不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過(guò)程中是起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的過(guò)程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程。半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的詞頭)Caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類ICE亞類Caspase蛋白酶：ICE是單核細(xì)胞來(lái)源的參與成熟的一種蛋白酶，參與凋亡但不起主要作用；Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡啟動(dòng)亞類Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7Caspase家族的特點(diǎn)

以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和異源活化,活化后形成四聚體的蛋白水解酶，發(fā)揮生物學(xué)作用

C端同源區(qū)存在半光氨酸激活位點(diǎn)

Caspase分：?jiǎn)?dòng)酶和效應(yīng)酶

Caspase活化機(jī)制：

Caspase的活化是有順序的多步水解的過(guò)程，雖然分子各異，但是它們活化的過(guò)程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體,Caspase的效應(yīng)機(jī)制

凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜活化，細(xì)胞皺縮，最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬。破壞細(xì)胞抗凋亡因素破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能破壞細(xì)胞抗凋亡因素正?；罴?xì)胞因核酸酶處于無(wú)活性狀態(tài)，這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起，如抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。現(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD），而把它的抑制物稱為ICAD。有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性，因而ICAD對(duì)CAD的活化與抑制是必需要的。

破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（Lamin）是由核纖層蛋白通過(guò)聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。6影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能Caspase可作用于多種與DNA，RNA功能有關(guān)的蛋白如滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。六.細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)

1.Bcl-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2）B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延長(zhǎng)細(xì)胞的生存，能抑制細(xì)胞凋亡,而不是促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員，所有Bcl-2家族成員均含有1個(gè)或多個(gè)BH結(jié)構(gòu)域。蛋白含有4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域，依次命名為BHl、BH2、BH3和BH4。可分為3個(gè)亞族：Bcl-2亞家族：Bcl-2Bcl-xlBcl-w、Mcl-1、A1。Bcl-2亞家族成員對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用

Bax亞家族：Bax、Bak、Bok，它們的作用與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

BH3亞家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；僅有BH3結(jié)構(gòu)域。它們的作用也與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

作用機(jī)制：影響APAF1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能2.VDAC和ANT

是線粒體外膜上最為豐富的兩種蛋白。最近有一些研究工作表明，WDAC和ANT可與Bc1-2家族蛋白相互作用，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中介導(dǎo)對(duì)線粒體的損傷。VDAC本身是一種通道蛋白，它與Bax的結(jié)合可使共通道性能發(fā)生某種變化，這樣一些凋亡蛋白如cytC就可通過(guò)。因?yàn)檫@兩種蛋白在跨越線粒體膜的核苷酸和小分子轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用，所以它們與Bax的結(jié)合可能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體ATP/ADP轉(zhuǎn)化和磷酸肌酸外運(yùn)的抑制有關(guān)。3.P53與細(xì)胞凋亡

P53是腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。P53基因是人類腫瘤有關(guān)基因中突變頻率最高的基因。在依賴P53蛋白的細(xì)胞凋亡中，P53基因是通過(guò)調(diào)節(jié)Bc1-2和Bax基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡的。P53蛋白能特異地抑制Bc1-2的表達(dá)，相反對(duì)Bax的表達(dá)則有明顯的促進(jìn)作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的轉(zhuǎn)錄活化因子。在這些細(xì)胞中，P53蛋白的積累和活動(dòng)引起了細(xì)胞凋亡。4.IAP（inhibitorofapoptosis，細(xì)胞凋亡抑制因子）

IAP超家族的成員較多，如c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP和Survivin，新的成員在不斷的被發(fā)現(xiàn)。IAP家族成員有一個(gè)共同的特征，含有一個(gè)或多個(gè)７０個(gè)氨基酸的重復(fù)序列（BIR），類似于zinc指狀的結(jié)構(gòu)。c-IAP1、c-IAP2和XIAP含有環(huán)指裝結(jié)構(gòu)。BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導(dǎo)對(duì)caspase的抑制作用，而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導(dǎo)caspase－３和－７的泛素化降解作用。5.Smac/Dablo

在細(xì)胞凋亡過(guò)程中它可以從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個(gè)新的N基端,這個(gè)N基端的前面4個(gè)氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合。Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對(duì)胱解酶9的抑制，促進(jìn)凋亡。

七.細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義細(xì)胞凋亡與個(gè)體發(fā)育細(xì)胞凋亡與免疫細(xì)胞凋亡與人類疾病免疫細(xì)胞凋亡胸腺細(xì)胞成熟過(guò)程中的凋亡陽(yáng)性選擇陰性選擇激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）

CTL誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡：穿孔素介導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡

Fas介導(dǎo)的靶細(xì)胞凋亡B細(xì)胞凋亡:經(jīng)過(guò)基因重排,92%的細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡與人類疾病細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)的疾病

惡性腫瘤:濾泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病自身免疫性疾?。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎病毒感染性疾?。合俨《静?、庖疹病毒病細(xì)胞凋亡增多有關(guān)的疾病

艾滋?。荷窠?jīng)變性性疾?。涸缋闲赃t呆、帕金森病、小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病缺血性疾病酒精中毒性肝炎八.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法.一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè).二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、線粒體膜勢(shì)能（mt）的檢測(cè)四、DNA片斷化檢測(cè)

五、TUNEL法六、Caspase-3活性的檢測(cè)

七、WB檢測(cè)八、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月?tīng)罡皆诤四ぶ車?熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。3電子顯微鏡觀察NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess（488nm400）電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞