分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)七

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)七限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒DNA

1第3周分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備簡(jiǎn)介和實(shí)驗(yàn)有關(guān)內(nèi)容介紹第4周從植物組織提取DNA第5周從動(dòng)物組織提取DNA第7周原核細(xì)胞質(zhì)粒DNA的提取第8周核酸的瓊脂糖凝膠電泳第9周紫外吸收測(cè)定核酸含量第10周限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒DNA第11周凝膠電泳回收和純化DNA片段第12周細(xì)菌感受態(tài)的制備第13周質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化第14周目的基因的PCR擴(kuò)增與檢測(cè)第15周原核蛋白質(zhì)SDS電泳第17周考試21、實(shí)驗(yàn)原理

限制性內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶（RestrictionEnzymeorRestrictionEndonuclease,簡(jiǎn)稱RE）是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶，并在此特異位點(diǎn)將雙鏈DNA切斷。限制性內(nèi)切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，也稱細(xì)菌性酶。限制性內(nèi)切酶是細(xì)菌為防范外源DNA而產(chǎn)生的一類酶，它可識(shí)別DNA雙鏈上的特異性位點(diǎn)，以內(nèi)切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵，并從該點(diǎn)將DNA分子切斷，產(chǎn)生DNA片段的5為P，3為OH,而宿主內(nèi)的DNA則因它的一些特異性位點(diǎn)常常由于其中的一個(gè)堿基的甲基化被保護(hù)起來,使此位點(diǎn)不再成為限制酶的底物。限制性內(nèi)切酶是基因工程技術(shù)中不可缺少的工具，也稱為工具酶。

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限制性內(nèi)切酶的高度特異性與反應(yīng)條件有關(guān)。每種酶都要求最適合的反應(yīng)條件，如緩沖液和甘油濃度等，當(dāng)這些條件改變時(shí)，某些酶的識(shí)別序列將改變。限制性內(nèi)切酶多保存在甘油之中，商品酶制劑一般含有50%的甘油，它起著穩(wěn)定酶活性的作用。而在酶反應(yīng)體系中，甘油量太大會(huì)抑制酶的活性。為此，要求一般酶甘油制劑的使用量應(yīng)小于反應(yīng)體系體積的10%。例如反應(yīng)體積為20l時(shí)，使用的酶制劑不可大于2l。

一般限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液要求有三種基本物質(zhì)：Tris-Hcl（pH7.5）、MgCl2和NaCl。不同酶需要這三種物質(zhì)在緩沖液中的濃度各不相同。DTT（二硫蘇代糖）或用-巰基乙醇，主要起保護(hù)酶活性的作用。4反應(yīng)體系中限制性內(nèi)切酶的用量與如下兩方面有關(guān)系：（1）DNA的分子量：酶切相同重量的DNA，分子量大的，分子數(shù)就少，所以使用的酶量就少些，因而酶用量與DNA的分子量成反比。（2）酶切位點(diǎn)的多少：在DNA分子中切口多的酶，因每個(gè)切口都需要酶作用，因而酶的用量就相對(duì)多些，切口少的酶則用量就相對(duì)少些，所以酶用量與DNA分子上的切口數(shù)成正比。52、限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA的反應(yīng)本實(shí)驗(yàn)用BamHI和HindIII酶“切割”質(zhì)粒pMD18-T-kfNHX。已知pMD18-T-kfNHX質(zhì)粒上只1個(gè)BamHI和HindIII酶切口，kfNHX的堿基序列長(zhǎng)為約1700bp,被酶切后，出現(xiàn)兩條帶在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中可以觀察到。63、材料與儀器

3.1質(zhì)粒：根據(jù)具體情況而定；3.2限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和HindIII；3.3微量加樣器；3.4EP管；3.5水浴鍋或37C培養(yǎng)箱；3.6電泳設(shè)備；3.7凝膠成像系統(tǒng)

4、試劑與配制20ul反應(yīng)體系：10×Kbuffer2μl，BamHI0.5μl，HindIII

0.5μl,sample:根據(jù)質(zhì)粒樣品的濃度加8μl，加水補(bǔ)足20μl37C反應(yīng)3-4小時(shí)。0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，照相貯存75、思考題：1.影響酶切結(jié)果的主要因素有哪些，請(qǐng)正確分析你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.限制性內(nèi)切酶可用于分子生物學(xué)的哪些方面？8圖1.ＲＴ-ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜Fig.1AmplificationofKfNHXbyRT-PCR