博導論壇-樣品預處理技術的研究進展

梅素容華中科技大學同濟醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學研究所環(huán)境與健康教育部重點實驗室復雜樣品預處理技術的研究進展個人簡介1991.9-1995.7四川大學環(huán)境系環(huán)境監(jiān)測專業(yè)本科1995.9-1998.7武漢大學化學系分析化學專業(yè)碩士1998.9-2001.7武漢大學化學系分析化學專業(yè)博士2001.8-2003.9華中科技大學環(huán)境學院工作2003.9-2005.10華中科技大學公共衛(wèi)生學院博士后2005.11-至今華中科技大學公共衛(wèi)生學院工作2008.12-2009.5德國慕尼黑大學臨床化學研究所訪問學者2010.4-2010.11韓國昌原國立大學化學系訪問學者背景為了探討環(huán)境因素對健康的影響，需要從個體暴露、個體效應和人群效應等多個角度，深入分析環(huán)境與健康之間的關系。（隊列研究）個體暴露主要檢測復雜的環(huán)境和食品樣品中低濃度污染物。個體效應主要檢測外來污染物進入人體后在體內的分布和代謝水平。人群效應主要檢測大量人群樣本中相應的生物標記物和代謝標記物，可以準確評價個體暴露、群體暴露、個體和群體效應，因此特別適合環(huán)境污染物對人體健康危害的綜合評價。

樣品前處理技術簡介固相萃取技術固相微萃取技術液相微萃取超臨界流體萃取微波萃取加速溶劑萃取本課題組相關的代表性研究工作提綱復雜樣品前處理在樣品分析中的地位樣品前處理的目的樣品前處理的評價準則經(jīng)典的樣品前處理技術樣品前處理技術簡介復雜樣品前處理在樣品分析中的地位樣品分析流程：采樣（6.0％）樣品前處理（61.0％）分析測試（6.0％）數(shù)據(jù)處理及整理報告（27.0％）樣品前處理的目的提高測試精度提高方法的選擇性使樣品易保存和運輸延長測試儀器的使用壽命。。。。。。檢測痕量組分復雜的體系樣品預處理新技術與方法的探索與研究已成為當代分析化學以及相關交叉學科的重要課題與發(fā)展方向之一。不能檢測濃縮痕量的被測組分將待測組分與母體或基體分離衍生化主要的作用是富集和凈化樣品前處理的評價準則是否能最大限度地除去影響測定的干擾物；被測組分的回收率是否高；操作是否簡便、省時；成本是否低廉；對人體及環(huán)境是否產(chǎn)生影響。經(jīng)典的樣品前處理技術液－液萃取蒸餾索氏萃取沉淀離心大量使用有機溶劑處理時間長操作步驟多較大誤差影響操作人員健康污染周圍環(huán)境基本原理：與液相色譜（HPLC）分離過程相仿，是一種吸附萃取，主要適用于液體樣品的處理。當試樣通過裝有合適的固定相時，被測組分由于與固定相作用力較強被吸附留在柱上，并因吸附作用力的不同而彼此分離，樣品基質及其他成分與固定相作用力較弱而隨水流出萃取柱。分類：反相SPE、正相SPE和離子交換SPE與HPLC不同之處有：

1.填料粒徑（>40m)要比HPLC填料（3－10m

）大；

2.柱效低，通常只有10－50塔板。固相萃?。╯olid-phaseextraction,SPE）SPE的優(yōu)點(1)簡單、快速和簡化了樣品預處理操作步驟,縮短了預處理時間。(2)處理過的樣品易于貯藏、運輸,便于實驗室間進行質控。(3)可選擇不同類型的吸附劑和有機溶劑處理各種不同類的有機污染物。(4)不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,提高了分離效率。(5)僅用少量的有機溶劑,降低了成本。(6)易于與其他儀器聯(lián)用,實現(xiàn)自動化在線分析。SPE裝置SPE的基本步驟舉例：反相萃取柱C18,C8,Phenyl,CN,NH2活化：甲醇、乙腈等，1倍柱管體積或3倍柱床體積3-5mL/min平衡：水，1倍柱管體積或3倍柱床體積,3-5mL/min上樣：水溶液（緩沖劑稀釋）生物流體等,1mL/min淋洗：含5-50%極性有機溶劑的緩沖水溶液，1-2倍柱管體積或5-10倍柱床體積，1-2mL/min洗脫：極性或非極性有機溶劑，可選加水、緩沖劑、酸、堿等調節(jié)劑；2-4倍柱床體積。上樣：流出與吸附劑作用最弱的雜質；極性最強淋洗：流出與吸附劑作用比目標物弱的雜質；極性比目標物強淋脫：流出目標物活化：洗脫與吸附劑作用比目標物強的雜質；極性比目標物弱SPE的研究進展之一：新型吸附劑

常規(guī)的SPE吸附劑類型共同的缺點：選擇性差SPE的研究進展之一：新型吸附劑抗體鍵合吸附劑

充分利用了生物免疫抗原－抗體之間的高靈敏度和高選擇性，尤其適應于水中痕量有機物的富集與分離，將抗體鍵合到反相吸附劑的硅膠表面或聚合物表面，就制得了抗體鍵合吸附劑。研制開發(fā)能專門檢測各種優(yōu)先污染物的單克隆或多克隆抗體已成為SPE技術的前沿研究領域（如多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、有機氯農(nóng)藥、有機磷農(nóng)藥、以及一些環(huán)境激素類物質的單克隆抗體等。

缺點：生物活性物質易失活，缺乏保存和操作的不穩(wěn)定性，并且在制備和純化方面條件苛刻，成本較高，操作繁瑣，費時費力，SPE的研究進展之一：新型吸附劑

人工抗體吸附劑（分子印記聚合物，MIPs）

基本原理：以目標分子（待測物）為印記分子，將結構互補的功能化聚合物單體分子通過共價鍵或非共價鍵的方式與印記分子結合形成某種可逆的復合物，加入交聯(lián)劑將這種復合物“凍結”起來，制得高聚物，然后將印記分子提取出后所形成的對印記分子具有“預定”選擇性的分子識別位的大分子聚合物即為MIPs，又被稱為“人工抗體”，

特點：特異性可以和生物抗體相媲美，同時具有一定的機械和化學強度，對酸、堿、有機溶劑、溫度和壓力均有一定的耐受性，比生物抗體易于合成和保存。目前MISPE用于復雜樣品預處理和濃縮富集是十分有效的。

分子印跡聚合物（MIPs）的制備過程分子印跡技術（molecularimprintedtechnology,MIT）分子識別設想首次合成發(fā)展酶/底物抗原/抗體激素/受體Pauling

抗原為模板合成抗體，1940Wulff,MIP,1972Mosbach,Nature

,1993SPE的研究進展之二：萃取方式固相膜萃取

將SPE吸附劑附載于微孔濾膜可以制成萃取膜，常用于處理大體積水樣。膜片0.45微米的孔徑對過濾懸浮顆?；蛭⑸镆灿泻芎玫男Ч?，是EPA推薦的樣品預處理技術之一（EPA525），并已開始在國內應用。SPE的研究進展之二：萃取方式固相微萃?。╯olidphasemicroextraction,SPME）

SPME是在SPE技術的基礎上發(fā)展起來的一項新的樣品預處理技術。它用一個類似氣相色譜微量進樣器的萃取裝置在樣品中萃取出待測物后直接與GC或HPLC聯(lián)用，在進樣口將萃取的組分解吸后進行色譜分離與分析檢測。該法從完成萃取到分析的整個過程只需十幾分鐘，主要用于揮發(fā)性或半揮發(fā)性有機污染物的凈化、富集?；|固相分散技術（Matrixsolid-phase

dispersion,MSPD）

1989年,美國Barker首次提出可同時分散與萃取固體、半固體樣品的MSPD技術。該方法將涂漬有C18等多種聚合物的擔體固相萃取材料與樣品一起研磨所得到的半干狀態(tài)的混合物作為填料裝柱,然后采用類似SPE的方法,用不同的淋洗劑洗脫出各種待測物。與SPE比較,

優(yōu)點:濃縮了傳統(tǒng)樣品前處理過程中的樣品均勻化、組織細胞裂解、提取和凈化等過程,從而減少了組織勻漿、沉淀、離心、pH調節(jié)和樣品轉移等操作步驟，避免了樣品的損失。適用于各種固體、半固體樣品中農(nóng)藥多殘留分析的提取凈化。

SPE的研究進展之二：萃取方式QuEChERS(Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe)方法

QuEChERS方法由Anastassiades和Lehotay等于2003年提出的一種基于固相萃取和基質固相分散技術的樣品預處理方法，具有快速(quick)、簡單(easy)、便宜(cheap)、有效(effective)、可靠(rugged)和安全(safe)等特點。

步驟：首先用乙腈作為提取溶劑，振蕩提取，同時加入氯化鈉和無水硫酸鎂通過液液分配除水，然后取部分萃取液經(jīng)無水硫酸鎂和PSA(N-丙基乙二胺填料)分散固相萃取凈化后,用色譜等進行分析。SPE的研究進展之二：萃取方式攪拌棒吸附萃取(stirbarsorptiveextraction,SBSE)

SBSE技術由Sandra等在1999年首先提出并由GerstelGmbH商品化，是一種新型的無溶劑或少溶劑，集萃取、凈化、富集為一體的樣品前處理技術。萃取時，攪拌棒在完成攪拌的同時吸附目標物，可消除攪拌磁子的吸附競爭，同時使用非常簡便。SPE的研究進展之二：萃取方式(a)浸入式和(b)頂空式萃取方式(a)整體材料為涂層的SBSE示意圖、(b)不同尺寸的SBSEM的照片和(c)SBSEM的截面圖磁性固相萃取(magnetic

solid-phaseextraction,MSPE)

MSPE是一種以磁性或可磁化的材料作為吸附劑基質的一種固相萃取技術，在MSPE過程中，磁性吸附劑不需要填充到吸附柱中，而是被添加到樣品的溶液或者懸浮液中，將目標分析物吸附到分散的磁性吸附劑表面，在外部磁場作用下就可使目標分析物與樣品基質分離開來。優(yōu)點：1、萃取過程簡單化，不需要昂貴的設備；2、化學物質的使用量大為減少，沒有二次污染產(chǎn)生；3、可以萃取溶液或懸浮液中的目標分析物，且由于樣品中的雜質一般都是反磁性物質，能有效地避免雜質的干擾。SPE的研究進展之二：萃取方式SPE的在線聯(lián)用技術越來越受到人們的重視，逐漸成為快速、靈敏、可靠的分析方法之一。在線操作時，SPE柱富集的全部待分析物直接進入儀器，使萃取效率大大提高，減少了操作者與有毒試劑接觸的機會，且縮短了分析時間。在線分析的重現(xiàn)性、準確性都有較大改善，回收率也有較大提高，還能改善檢測限，并適用于野外的實時自動化連續(xù)檢測。SPE的研究進展之三：在線聯(lián)用技術SPE的應用用SPE凈化和富集的EPA方法FoodChemistry93(2005)349–353MISPENISPEC18不同的固相萃取后HPLC檢測干辣椒醬中的蘇丹紅ⅠMISPE的應用實例：干辣椒醬中蘇丹紅Ⅰ的檢測固相微萃?。╯olidphasemicroextraction,SPME）基本原理：利用待測物在基體和萃取相間的非均相平衡，使待測組分擴散吸附到石英纖維表面的固定相涂層，達到待測組分進行提取和富集的目的。于1989年由加拿大Waterloo大學的J.Pawliszyn教授等首次提出。1993年美國的Supelco公司推出了商品化的SPME設備。SPME操作簡單、攜帶方便、操作費用低廉，另外克服了SPE吸附劑孔道易堵塞的缺點。SPME的裝置及萃取過程SPME的裝置及萃取過程SPME方法分為萃取過程和解吸過程：1.萃取過程。將萃取器針頭插入樣品瓶內，壓下活塞，使具有吸附涂層的萃取纖維暴露在樣品中進行萃取，經(jīng)一段時間后，拉起活塞，使萃取纖維縮回到起保護作用的不銹鋼針頭中，然后拔出針頭完成萃取過程。2.解吸過程。熱解析：在GC分析中采用熱解吸法來解吸萃取物質。將已完成萃取過程的萃取器針頭插入氣相色譜進樣裝置的氣化室內，壓下活塞，使萃取纖維暴露在高溫載氣中，并使萃取物不斷地被解吸下來，進入后續(xù)的氣相色譜分析。溶劑解吸：利用HPLC專用的SPME解吸接口解吸或將萃取纖維插入一定的解吸溶劑中進行解吸，進入后續(xù)的HPLC分析。SPME的應用:

多環(huán)芳烴及鄰苯二甲酸酯SPME的應用：PBDEsZhangW,WuCY,XingJ,etal.AnalChem,2009,81:2912圖

水樣中7種PBDEs的HSSPME-GC-ECD色譜圖1—BDE-35；2—BDE-47；3—BDE-77；4—BDE-100；5—BDE-99；6—BDE-154；7—BDE-153SPME-GC/MS分析尿樣的色譜圖a－疑似藥物濫用者的尿樣；b－加標的空白尿樣（加標濃度為50ng/mL）。1－苯丙胺（AMP）；2－甲基苯丙胺（MAP）；3－3，4-亞甲二氧基苯丙胺（MDA）；4－3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）；5－亞甲基-二氧乙基苯丙胺（MDEA）SPME的應用：毒品及濫用藥物分析ChiaK,HuangS.Anal.Chim.Acta,2005,539:49-54液相微萃取技術(liquid-phasemicroextrac

tion,LPME)是1996年由Cantwell等提出的一種新型樣品前處理技術,其基本原理是目標分析物在樣品與微升級的萃取溶劑之間達到分配平衡,從而實現(xiàn)溶質的微萃取。LPME克服了傳統(tǒng)液液萃取技術繁瑣、浪費、污染等缺點,具有消耗溶劑少(僅需μL

級),富集倍數(shù)大,萃取效率高,操作更簡便,便于實現(xiàn)分析的自動化等優(yōu)點。主要萃取方式:單滴液相微萃取(single-dropliquid-phasemicroextraction,SDME),中空纖維保護膜微萃取(hollowfiber-basedliquid-phasemicroextrac

tion,HF-LPME),分散液液微萃取(dispersiveliquid-liquidmicroextraction,DLLME)等。液相微萃?。╨iquidphasemicroextraction,LPME）單滴液相微萃取（SDME）單滴液相微萃?。⊿DME）指萃取溶劑形成單滴，懸掛于微型注射器的針尖來進行萃取。萃取劑體積一般為幾微升，相比于傳統(tǒng)的LLE降低了萃取相/水相的比例，從而提高了富集效率。兩種模式：直接浸入萃?。―I-SDME)和頂空萃取（HS-SDME)。DI-SDME指萃取溶劑直接浸入樣品溶液中進行萃取，穩(wěn)定性較差，會隨著攪拌的進行而損失或脫落，多適于基質較簡單的樣品。HS-SDME將萃取液滴懸掛于樣品溶液上方的頂空部分，適合于復雜樣品中揮發(fā)性、半揮發(fā)性分析物的萃取。穩(wěn)定性較好，降低了樣品中非揮發(fā)性基質的干擾，使萃取所得目標物較干凈，是目前主要模式。直接浸入萃取法

頂空萃取法中空纖維膜微萃取(HF-LPME)HF-LPME核心為“有機膜”，利用有機溶劑滲透到多孔中空纖維膜壁，形成有機溶劑膜為中間相或與膜內溶劑一起形成接收相。增加了萃取相與樣品溶液的接觸面積，中空纖維膜的使用能夠排除大分子物質的干擾，并增加了萃取相的穩(wěn)定性，準確度和靈敏度也有所提高。兩種模式：兩相和三相。兩相HF-LPME是將一定長度多孔聚丙烯中空纖維膜超聲清洗晾干后，浸入有機溶液中，使纖維壁形成有機溶劑膜。然后用微量注射器注入一定體積有機溶劑至纖維膜腔內。隨后，將上述中空纖維置入樣品溶液或者樣品頂空進行萃取，萃取后接收相多用GC分析。三相HF-LPME利用中空纖維有機膜為中間轉移相，第三相則通過微型注射器注入膜內，一般為水相，適合于HPLC、CE分析。三相HF-LPME常用于分析離子分析物。兩相三相分散液液微萃取(DLLME)2006年由Assadi等提出DLLME技術。首先在已加入一定體積樣品溶液的離心管中迅速注入分散劑和萃取劑的混合溶液。在分散劑的幫助下，萃取劑極易分散到樣品溶液中形成無數(shù)微小液滴，從而使體系形成水/分散劑/萃取劑的乳濁液。通過超聲、溶劑攪拌等方法讓萃取劑與樣品溶液充分接觸，促使目標分析物從水相轉移至萃取相，快速達到平衡，獲得良好的富集效果。經(jīng)離心后，萃取相沉積于管底，用微量注射器采集進行分析測試。萃取劑多為密度比水大的有機溶劑，如氯苯、四氯化碳等。萃取劑的用量一般在幾微升到數(shù)十微升，通常為整個萃取體系總體積的1％～3％。分散劑則選用易溶于水的極性溶劑，如丙酮、甲醇、乙腈等。應用實例DLLME用于環(huán)境水樣中痕量有機磷農(nóng)藥的萃取超臨界流體萃取(Supercriticalfluidextraction,SFE)基本原理：SFE也是在兩相之間進行的一種萃取方法，所不同的是萃取劑是利用超臨界流體SCF（Supercriticalfluid,即其溫度和壓力略超過或靠近臨界溫度Tc和臨界壓力Pc，介于氣體和液體之間的流體），從固體或液體中萃取出某種高沸點或熱敏性成分，以達到分離和提純的目的。SCF的密度較大，與液體相仿，所以它與溶質分子的作用力很強，像大多數(shù)液體一樣，很容易溶解其他物質;同時它的粘度較小，接近于氣體，傳質速度很高；加之表面張力小，很容易滲透到固體顆粒，并保持較大的速度，可以使萃取過程在高效、快速的條件下完成，是一種十分理想的萃取劑。最常用的超臨界流體是CO2,可用于萃取非極性和中等極性的物質?，F(xiàn)在也對其它氣體進行了研究,如N2O、C2H6、C3H8NH3、CHF3

等。不同物態(tài)時CO2的性質SFE的應用根據(jù)超臨界流體的性質可知，它特別適合于處理烴類及非極性脂溶化合物，如醚、酯、酮及其它分子量達300至400道爾頓的化合物，在低于300bar的壓力下，很容易將它們從樣品基體中萃取出來，但如果樣品分子中含羥基或羧基等極性基團，就會使萃取較為困難。對于糖類、糖苷、氨基酸、卵磷脂類極性物質，以及蛋白質、核酸、纖維素、多萜類等天然大分子與合成的極性高分子，SFE至今還不是一種最佳的選擇。SFE在處理環(huán)境樣品中的典型應用微波輔助萃?。∕icrowaveaidedextraction,MAE）MAE是利用微波加熱來加速溶劑對固體樣品中目標物質的萃取過程。它具有設備簡單、高效、快速、試劑用量少，可同時處理多個樣品等優(yōu)點。微波萃取主要適合于固體或半固體樣品，樣品制備整個過程包括粉碎、與溶劑混合、微波輻射、分離萃取液等步驟。所需的主要設備是（1）帶有控溫附件的微波制樣設備；（2）微波萃取用制樣杯，一般為聚四氟乙烯材料制成的樣品杯。萃取步驟：準確稱取一定量已粉碎的待測樣品置于微波制樣杯內，根據(jù)萃取物情況加一定量的適宜萃取溶劑（不超過50ml）。將裝有樣品的制樣杯放到密封罐中，然后把密封罐放到微波制樣爐里。設置目標溫度和萃取時間，加熱萃取。加速溶劑萃取（Acceleratedsolventextraction,ASE）ASE是通過改變萃取條件，以提高萃取效率和加快萃取速度的新型高效的萃取方法。通常是在提高溫度和壓力的條件下，用有機溶劑萃取的自動化方法。其突出的優(yōu)點是有機溶劑用量少、快速、回收率高。該法目前已被美國EPA選定為推薦的標準方法。ASE可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的溶劑萃取和液