基因操作和其醫(yī)學應用

基因操作和其醫(yī)學應用基因操作的概念

基因操作的基本策略定義：在基因水平上進行人工操作并改變其生物遺傳性的技術稱基因操作。所采用的主要手段為DNA重組技術，主要程序是將DNA片段插入到質粒、病毒等載體中，形成遺傳物質的新組合，然后轉移到宿主細胞產生新的表型。基因操作和其醫(yī)學應用WhatistheGene?

基因（gene）是核酸鏈上貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質多肽信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列?；虿僮骱推溽t(yī)學應用WhatistheGenome?

基因組（genome）指細胞或生物中，一套完整單倍體遺傳物質的總和，包括全套基因及間隔序列。人類基因組包含22條常染色體和XY兩條性染色體（核基因組）以及線粒體上的遺傳物質（線粒體基因組）。基因操作和其醫(yī)學應用原核基因組和真核基因組真核生物基因組遠遠大于原核生物的基因組，結構復雜，基因數龐大，具有許多復制起始點，每個復制子大小不一人類染色體單倍體DNA全長3×109bp，含3~4萬個基因。大腸桿菌DNA全長106bp，含4000個基因?；虿僮骱推溽t(yī)學應用原核基因組

ProkaryoteGenome

基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成?；蚪M中只有1個復制起點?；蚪M中的重復序列很少，編碼蛋白質結構基因多為單拷貝?；窘Y構特點：啟動子（promoter）、操縱基因（operator）、調控序列、結構基因（structuregene）、終止子（terminator）?；蛐蛄惺沁B續(xù)的，無內含子結構連續(xù)密碼區(qū)mRNA→Protein基因操作和其醫(yī)學應用基本結構：結構基因（structuralgene）指能轉錄成為mRNA、rRNA或tRNA的DNA順序。結構基因不連續(xù)，編碼序列被非編碼序列打斷，分割成幾段，編碼序列稱為外顯子(exon)，其間的序列稱為內含子(intron),稱為斷裂基因（splitgene）。

非編碼區(qū)剪切編碼區(qū)編碼區(qū)mRNAProtein

真核基因組

EukaryoteGenomeintronexonexon有大量重復序列基因操作和其醫(yī)學應用

獲取目的基因常常是基因操作的首要步驟?；瘜W合成法基因文庫法（或cDNA文庫法）

PCR法獲取目的基因基因操作和其醫(yī)學應用較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測序引物定點突變核酸雜交探針化學合成法基因操作和其醫(yī)學應用構建不同的基因文庫通過核酸雜交的篩選或通過抗原抗體反應的篩選基因文庫法獲取目的基因基因操作和其醫(yī)學應用

聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。是獲取已知序列候選基因的主要方法。PCR法基因操作和其醫(yī)學應用PCR技術的基本過程模板DNAdNTP引物Buffer預變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃基因操作和其醫(yī)學應用基因重組基因操作的關鍵步驟和核心內容關系到研究的成敗或質量包括：基因分離，基因組合，基因轉化，基因篩選基因操作和其醫(yī)學應用分:基因操作和其醫(yī)學應用切:限制性內切酶

“分子手術刀”

基因操作和其醫(yī)學應用限制性核酸內切酶命名Smith和Nathame命名原則（1973）

屬名+種名+株名+流水號

舉例：流感噬血桿菌d株

（Haemophilusinfluengaed）

HindⅠ

HindⅡ

HindⅢ5’AAGCTT3’

HindⅣ3’TTCGAA5’

基因操作和其醫(yī)學應用限制性核酸內切酶

restrictionendonuclease

在特異位點上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識別序列呈回文對稱（palindromesequence）5’GAATTC3’5’GGATCC3’

3’CTTAAG5’3’CCTAGG5’

基因操作和其醫(yī)學應用EcoRⅠ的識別序列5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’HaeⅠ的識別序列5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’基因操作和其醫(yī)學應用限制性核酸內切酶酶切單酶切

用一種限制酶酶切目的基因和載體易發(fā)生自身連接雙酶切

用二種限制酶酶切目的基因和載體不易發(fā)生自身連接基因操作和其醫(yī)學應用接:“分子針線”基因操作和其醫(yī)學應用目的基因片段與載體的連接

★粘末端法：堿性磷酸酶退火★平接法：T4噬菌體DNA連接★接頭法：人工合成識別順序

★聚尾法：分別加連polyA(T)或G基因操作和其醫(yī)學應用

是獨立于許多細菌及某些真核細胞染色體外共價閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小在1—200kb之間，能獨立復制的最小遺傳單位。質粒（plasmid）基因操作和其醫(yī)學應用質粒的分類克隆載體(cloningvector,Puc18,19)都有松弛的復制子，能帶動外源基因在宿主細胞中復制擴增。帶有一些基本元件（ori,Ampr,Mcs等），用來克隆和擴增基因片段。表達載體(Expressionvector,PET30a,pMV361)除了有克隆載體的基本元件，還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序。為了有效的轉錄，必需有強大的啟動子(Trp,Lac)。基因操作和其醫(yī)學應用

重組DNA的轉化與增殖制備CompetenceCell（氯化鈣處理幼嫩E.coli,yeast,動物cell,昆蟲.)C．Cell--——>”Hotshock”(42℃，2’)

——>L．B．Culture-->37℃，lhr．

-->LB．agar．plate-->genomiclibrary．轉:基因操作和其醫(yī)學應用1.陽性重組體的篩選抗藥基因抗Ampicilin基因

Ampicilin敏感受體細胞＋

Ampicilin培養(yǎng)基↓未轉化菌落不能存活篩:

基因操作和其醫(yī)學應用2.顏色反應

Lac+Polylinker+β-半乳糖苷酶Xgal藍色/白色利用基因操作和其醫(yī)學應用

3影印原位雜交（SituHybridization)菌落ＤＮＡ

硝酸纖維濾膜陽性重組體原位固定重組探針雜交基因操作和其醫(yī)學應用4.斑點雜交(DotBlots)

已知重組DNA濾膜重組DNA同源性和特異性方陣打點陽性重組DNA探針雜交基因操作的基本策略基因操作和其醫(yī)學應用5.southern雜交

DNA片段吸印重組探針雜交后處理基因操作和其醫(yī)學應用外源基因表達克隆基因在原核細胞中表達克隆基因在哺乳動物細胞中表達克隆基因在其它表達系統中表達昆蟲表達系統酵母表達系統基因操作和其醫(yī)學應用在原核表達體系（以Ecoli為代表）：優(yōu)點1.遺傳背景清楚,易于調控;2.表達技術經典成熟,應用廣泛,目前無以取代;3.目的基因表達水平高培養(yǎng)周期短，“物美價廉”.缺點1.缺少真核蛋白質翻譯后加工修飾系統,如剪切,糖基化,及正確二硫鍵形成等;2.表達蛋白質多以包涵體形式存在,需經復性才能恢復構象與活性；3.宿主本身雜蛋白質多,純化步驟復雜,故某些蛋白質,特別時糖蛋白或脂蛋白,酌情選擇真核表達載體?；虿僮骱推溽t(yī)學應用真核表達體系（酵母、昆蟲、哺乳動物細胞）

優(yōu)點：能轉錄后加工，即能剪接內含子；能翻譯后加工，即能糖基化修飾等；通常不形成包涵體，能正確折疊。

缺點：但技術難度較大，成本較高，表達量較低?；虿僮骱推溽t(yī)學應用轉基因和基因治療基因操作和其醫(yī)學應用

轉基因和基因治療

1．概念和研究現狀

2．基因治療的基本類型

3．轉基因的基本方法

4.轉基因的表達和調控

5．基因治療的運用和前景內容提綱基因操作和其醫(yī)學應用

基因治療是以正常基因替代或置換靶細胞染色質基因組中的致病基因從而產生新表型的治療方法。轉基因技術則是將目的基因導入靶細胞以建立治療效應的方法和過程。轉基因及基因治療基本概念基因操作和其醫(yī)學應用轉基因及基因治療基因治療的程序目的基因轉基因基因表達基因治療viralnonviralInvivoexvivo體內調控基因操作和其醫(yī)學應用基因治療的基本類型

★細胞介導的基因治療(exVivo)是當前較常用的形式。是選用適當的靶細胞載體外進行基因轉移，篩選陽性細胞重新移植入體內?？捎迷蚣毎颠M行。但靶細胞存活較短暫（Transit)?；虿僮骱推溽t(yī)學應用★體外表達基因治療(inVitro)

是傳統的基因表達形式。基因操作和其醫(yī)學應用1、病毒法(Viral)1)逆轉錄病毒(Restrovirus)RNA病毒，結構缺陷

PackagingCell轉基因及基因治療轉基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學應用★體內直接轉基因治療（inVivo）轉基因及基因治療基因治療的基本類型

是最有前途的方式。已在肝、氣管、肌肉、乳腺、腹腔動、靜脈初獲成功。效果持久。但轉移和表達效率低。基因操作和其醫(yī)學應用優(yōu)勢：①整合率高;②對外源DNA影響小;③單拷貝整合，利于表達調控；④安全。轉基因及基因治療轉基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學應用劣勢：①容量小;②只能感染分裂活躍細胞，體外(Exvivo)轉基因;③Transiteexpression;④R.V.+P.C+P.C實驗室要求高。轉基因及基因治療轉基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學應用2）腺病毒(Adenovirus)

腺相關病毒(Adenoassociatedvirus)DNA病毒

E1和E3基因缺乏

263細胞系生長轉基因及基因治療轉基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學應用特點：①能感染靜止細胞，體內(invivo)轉基因②對某些細胞類型特別親和力，利于局部基因治療③包容量大④尚無PackagingCell，欠安全⑤有較強免疫原性，易引起體內免疫反應轉基因及基因治療轉基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學應用2、非病毒法(Nonviral)1）顯微注射法(Microinjection)2)基因定位整合技術(Genetargeting)3)受體介導(Receptor-mediatedmethods)4)組織內直接注射(DirectinjectionofDNA)5)磷酸鈣沉淀法(CaPO4precipitation)轉基因及基因治療轉基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學應用1、腫瘤的基因治療

1)腫瘤的免疫基因治療．★載體細胞靶向表達細胞因子載體細胞:腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)

淋巴因子激活的殺傷細胞(LAKs)

細胞因子:IL-1,2,4,6,7,IFNs，TNF-α,CSF?！锬[瘤疫苗:改變腫瘤細胞免疫原性，誘導強烈免疫反應轉基因及基因治療基因治療的應用基因操作和其醫(yī)學應用2)反義技術抑制腫瘤基因功能人工合成癌基因DNA或RNA(mRNA)互補寡核苷酸，“封閉”癌基因的轉錄或翻譯。轉基因及基因治療基因治療的應用基因操作和其醫(yī)學應用3)病毒導向酶解藥物前體療法(VDEPT)---“自殺基因”(Suicidegene)

該基因編碼的酶能活化無毒藥物前體殺傷該酶所在的細胞。將“自殺基因”轉染腫瘤細胞，使用對正常細胞無毒藥物前體，選擇殺傷腫瘤細胞。轉基因及基因治療基因治療的應用基因操作和其醫(yī)學應用轉基因及基因治療基因治療的應用(肝癌細胞）單純皰疹胸苷激酶(HSV-Tk)甲氧嘌呤阿拉伯糖苷AM(D.T)

阿拉伯糖苷酸殺傷肝癌細胞（無毒前體）活化基因操作和其醫(yī)學應用2．傳染病基因治療

1）刺激更強的機體抗HIV免疫反應轉基因及基因治療基因治療的應用(HIV患者