研究多肽與蛋白質(zhì)類藥物

研究多肽與蛋白質(zhì)類藥物第一節(jié)、多肽及蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)方法一、蛋白質(zhì)類藥物的分離與純化：（一）材料選擇：來(lái)源有動(dòng)植物組織、微生物等，原則上是選擇富含目的蛋白質(zhì)或多肽成分的、易于獲得和易于提取的無(wú)公害生物材料。對(duì)于天然蛋白質(zhì)類藥物，為提高質(zhì)量、產(chǎn)量和降低成本，對(duì)原料的種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來(lái)源、解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌或細(xì)胞都有一定的要求。比如：（1）種屬：如牛胰含胰島素單位比豬胰高，而牛胰島素的抗原性比豬胰島素抗原性高。

（2）發(fā)育階段：如幼年動(dòng)物胸腺比較發(fā)達(dá)，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動(dòng)物。HCG在妊娠婦女60-70天的尿中達(dá)到高峰，等等。（3）生物狀態(tài)：如飽食后胰島素含量高；嚴(yán)重再生障礙性貧血患者尿中的EPO含量高，等等。

（4）原料來(lái)源：如血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學(xué)功能并餓二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來(lái)源為好。（5）原料解剖學(xué)部位：如豬胰臟中，胰尾部位含激素較多。而胃膜素以采取全胃黏膜為好；胃蛋白酶則以采取胃底部黏膜為好。（6）對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求：主要是考慮表達(dá)量、后處理的難易等。（二）蛋白質(zhì)提純的一般方法：1、根據(jù)等電點(diǎn)的不同來(lái)純化蛋白質(zhì)有等電點(diǎn)沉淀法、等電點(diǎn)沉淀和鹽析法聯(lián)用法、等電點(diǎn)聚焦法等2、根據(jù)蛋白質(zhì)分子形狀和大小的不同來(lái)純化蛋白質(zhì)有凝膠過濾法、超濾法、離心法、透析法等3、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的不同來(lái)純化蛋白質(zhì)有蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析法、結(jié)晶法、低溫下有機(jī)溶劑沉淀法4、根據(jù)蛋白質(zhì)電離性質(zhì)的不同來(lái)純化蛋白質(zhì)主要是離子交換層析法，有不同的離子交換劑和不同的交換層惜條件5、根據(jù)蛋白質(zhì)功能專一性的不同來(lái)純化蛋白質(zhì)主要手段是親和層惜法6、根據(jù)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)與相應(yīng)的載體基團(tuán)結(jié)合來(lái)純化蛋白質(zhì)可用疏水柱或反向HPLC來(lái)純化7、根據(jù)蛋白質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中分配的不同來(lái)純化蛋白質(zhì)主要是逆流分溶法（原理類似于萃?。?、根據(jù)蛋白質(zhì)受物理、化學(xué)等作用因素的影響來(lái)純化蛋白質(zhì)利用不同蛋白質(zhì)變性條件不同來(lái)分離不同的蛋白質(zhì)9、根據(jù)蛋白質(zhì)的選擇性吸附性質(zhì)來(lái)純化蛋白質(zhì)一些特殊的吸附層析法，如羥灰石、硅藻土、氧化鋁、活性炭等吸附10、根據(jù)酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用來(lái)純化蛋白質(zhì)如SOD能抗蛋白酶的水解，可用蛋白水解酶降解其它蛋白質(zhì)，以便于SOD的進(jìn)一步純化（三）蛋白質(zhì)的分離和純化1、時(shí)間因素：純化處理的時(shí)間要控制好2、選擇離子交換層析條件的程序：如離子交換劑的選擇及其使用條件的選擇3、蛋白質(zhì)分離純化的可能的技術(shù)手段的組合：（略）（四）溶液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定凱氏定氮法化學(xué)反應(yīng)法雙縮脲法福林-酚反應(yīng)法氨基黑測(cè)定法染色法考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法氯胺T測(cè)定法靈敏度較高的方法紫外吸收法放射性同位素測(cè)定法1、紫外吸收法（1）280nm光吸收法取3ml蛋白質(zhì)溶液，以緩沖液作為對(duì)照，用光徑為1cm的石英比色皿，在280nm處測(cè)定吸收值；以濃度1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液的A280為進(jìn)行估算；也可根據(jù)文獻(xiàn)查得相關(guān)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值，再計(jì)算。（2）280nm和260nm的吸收差法當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中含有核酸時(shí)，可用此方法進(jìn)行測(cè)定。分別測(cè)得A280和A260值，再按下列公式計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45A280–（3）215nm和225nm的吸收差法對(duì)于稀溶液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定可用此法。測(cè)得溶液的A215和A225值，再用下列經(jīng)驗(yàn)公式進(jìn)行計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）（A215–A225）2、雙縮脲法（1）常用雙縮脲法蛋白質(zhì)分子可與銅離子反應(yīng)形成紫紅色化合物，在540nm處比色測(cè)定，可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。本法測(cè)定范圍為1-10mg/ml。（2）微量雙縮脲法利用蛋白質(zhì)與銅離子形成的化合物在310nm-330nm處的吸收比540nm處的吸收大得多，因此，在蛋白質(zhì)濃度低時(shí)可用測(cè)定A310或A330值的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。此法比540nm法靈敏10倍以上。3、福林-酚試劑法本方法是雙縮脲法的發(fā)展。首先在堿性溶液中形成銅與蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后該復(fù)合物中的酪氨酸和色氨酸殘基還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），產(chǎn)生蘭色；再用比色法測(cè)定A750；測(cè)定范圍在；或在550nm處比色測(cè)定，測(cè)定范圍為。4、考馬氏亮藍(lán)G-250染色法（也有R-250）

G-250在酸性溶液中為棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后，變?yōu)樘m色，可在595nm比色測(cè)定。本法反應(yīng)快、操作簡(jiǎn)便、消耗樣品量少；但不同蛋白質(zhì)之間差異較大，且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差。測(cè)定范圍為。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨、去垢劑對(duì)測(cè)定有影響。G-250染色能力很強(qiáng)，比色皿一定要洗干凈，而且千萬(wàn)記住不能用石英比色皿。（1）溶液配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制、染色液配制。(p298)（2）測(cè)定方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線、測(cè)定未知樣品、比較、校準(zhǔn)。（五）純度檢查常用蛋白質(zhì)純度檢查方法有：1、HPLC或FPLC法常用的有效方法2、電泳法變性電泳和非變性電泳3、免疫化學(xué)法有免疫擴(kuò)散、免疫電泳、雙向免疫電泳擴(kuò)散、放射免疫分析、酶標(biāo)免疫分析等，依據(jù)是抗體抗原反應(yīng)。4、生物測(cè)定法生物效價(jià)測(cè)定和生物學(xué)功能測(cè)定5、分光光度法紫外分光光度法、紅外分光光度法二、多肽與蛋白質(zhì)的化學(xué)合成有固相合成法和液相合成法兩種；多肽合成的基本步驟有：①氨基保護(hù)和羧基活化；②羧基保護(hù)和氨基活化；③接肽和除去保護(hù)基團(tuán)。1、保護(hù)基團(tuán)：主要是保護(hù)一些活性基團(tuán)，如-NH2、-COOH、-SH等。氨基保護(hù)基是芐氧羰酰氯（Cb2-Cl），與氨基酸或肽上氨基作用形成芐氧羰酰氨基酸（Cb2-氨基酸）或Cb2-肽；可用氫化法或鈉氨法還原除去保護(hù)基團(tuán)。也可用叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）作保護(hù)基。羧基保護(hù)基常用無(wú)水乙醇或甲醇在鹽酸存在下進(jìn)行酯化；保護(hù)基可在皂化反應(yīng)是除去。精氨酸的胍基用對(duì)甲機(jī)基磺?；═os-）保護(hù)。其它活性基團(tuán)可用芐基（-B）保護(hù)，用鈉氨法還原除去保護(hù)基團(tuán)。2、肽的液相合成法：合成多肽的順序是從C-端到N-端；因?yàn)槌Ｓ敏然罨姆椒?，而不用氨基活化的方法（氨基活化易發(fā)生消旋化）。肽合成法可分為階梯伸長(zhǎng)法和片段縮合法。（1）階梯伸長(zhǎng)法：常用的羧基活化方法是混合酸酐法和活化酯法。

NCC法（N，N-二環(huán)己基碳二亞胺），首先使N-端保護(hù)的氨基酸同DCC反應(yīng)，形成酸酐后，加入另一氨基酸，縮合成肽。另一常用方法是活化酯法，帶有N保護(hù)基的氨基酸對(duì)硝基芳香族酯，能與另一氨基酸酯的氨基縮合成肽。（2）片段縮合法：由小肽合成大肽時(shí)常用疊氮法，而且應(yīng)該盡量利用Gly和Pro這兩個(gè)氨基酸的C-末端接肽，這樣不易消旋化。3、肽的固相合成法：肽鏈的延長(zhǎng)是在不溶性的聚苯乙烯樹脂載體沙鍋內(nèi)完成的。合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯樹脂反應(yīng)形成芐酯，然后按照肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的順序?qū)被艘驯槐Ｗo(hù)的氨基酸逐個(gè)加上去，使肽鏈延長(zhǎng)。固相合成法比液相法操作簡(jiǎn)便、時(shí)間縮短、可以自動(dòng)化。4、游離肽的獲得：合成多肽后，進(jìn)行分離純化，即可得到純的多肽了。固相法合成多肽示意圖第二節(jié)、多肽類藥物一、主要多肽類藥物：1、多肽激素：（1）垂體多肽類激素如促皮質(zhì)激素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激素（LPH）、催產(chǎn)素（OT）、加壓素（AVP）。（2）下丘腦激素如促甲狀腺激素釋放激素（TRH）、生長(zhǎng)素抑制激素（GRIF）、促性腺激素釋放激素（LHRH）。（3）甲狀腺激素如甲狀旁腺激素（PTH）、降鈣素（CT）。（4）胰島激素如胰高血糖素、胰解痙多肽。（5）胃腸道激素如胃必素、膽囊收縮素-促胰激素、腸必素等（6）胸腺激素如胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子。2、多肽類細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子：表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、轉(zhuǎn)移因子（TF）、心鈉素（ANP）3、含有多肽成分的其他生化藥物：骨寧、眼生素、血活素、氨肽素、蜂毒素、蛇毒素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素、胎盤提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素、腦安肽、助應(yīng)素、婦血寧等。二、主要多肽類藥物的制備：1、胸腺激素：（1）胸腺素（Thymocin）目前已經(jīng)藥用的是胸腺素組分5，由40-50種多肽組成的混合物，分子量在1KDa-15KDa之間。依據(jù)它們的等電點(diǎn)分為三個(gè)區(qū)域：α區(qū)包括等電點(diǎn)低于5的組分，β區(qū)包括等電點(diǎn)在5-7之間的組分，γ區(qū)包括等電點(diǎn)在7以上的組分。（2）工藝路線：工藝過程：提取低溫下勻漿、離心，得上清；加熱去雜蛋白加熱上清至80℃、15min，離心、得上清；沉淀冷至4℃、加-10℃丙酮沉淀，過濾得沉淀，干燥得丙酮粉；分段鹽析丙酮粉溶于pH7.0PBS，加硫銨至飽和度，沉淀、離心，得上清；調(diào)，再加硫銨至飽和度，得鹽析物；超濾鹽析物溶于的10mMTris-Cl，超濾，取分子量在15KDa以下的超濾液；脫鹽、干燥超濾液經(jīng)SephadexG-25脫鹽后、冷凍干燥，得胸腺素。（3）檢驗(yàn)方法：活力測(cè)定：E-玫瑰花結(jié)升高百分?jǐn)?shù)不得低于10%；分子量：必須低于15KDa。（4）作用與用途：（自己看看，p305）2、胸腺肽：（1）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：胸腺肽中主要是分子量為9600和7000左右的兩類蛋白質(zhì)或肽類，氨基酸組成達(dá)15種，必需氨基酸含量高，還含有少量核酸。對(duì)熱較穩(wěn)定（80℃時(shí)活性不降低），蛋白酶水解會(huì)使之失活。（2）生產(chǎn)工藝：工藝過程：原料處理取-20℃冷藏小牛胸腺，低溫下絞碎；制勻漿、提取低溫下加冷重蒸餾水（1:1），勻漿，浸漬提取；部分熱變性、離心、過濾勻漿液加熱至80℃、5min，冷至-20℃、2-3天；融化后4℃離心、微孔濾膜壓濾，得澄清濾液；超濾、提純將上述濾液用分子量截流值為1萬(wàn)以下的超濾膜進(jìn)行超濾，收取分子量在1萬(wàn)以下的活性多肽，-20℃冷藏。分裝、凍干經(jīng)檢驗(yàn)合格后，加入3%甘露醇作賦形劑，用微孔濾膜除菌過濾，分裝，凍干即得注射用胸腺肽。（3）檢驗(yàn)方法：活力測(cè)定同胸腺素；分子量10000以下。（4）作用與用途：（自己看看，p306）2、促皮質(zhì)素（ACTH）（1）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：是從垂體前葉提取的一種多肽激素；分子量：人為4567，豬為4593；易溶于水，等電點(diǎn)。100℃加熱活性不變。由39個(gè)氨基酸組成，種族差異僅僅在第25-33位上，1-24位的片段具有全部活性?？杀晃傅鞍酌覆糠炙?，但仍有活力。在水溶液中存在著高度α-螺旋。（2）生產(chǎn)工藝：工藝過程：提取垂體前葉干粉加醋酸20倍，用硫酸調(diào)節(jié)，70-75℃保溫10min，過濾。一次吸附提取液調(diào)，加投料量20%的CMC，3℃攪拌吸附12h，過濾。CMC用鹽酸解吸，解吸液用717陰離子交換樹脂處理，以上，過濾，調(diào)，冷藏。二次吸附在洗脫濾液中再加CMC，1-5℃攪拌吸附12h，過濾，CMC用醋酸、蒸餾水、醋酸銨（）及醋酸銨（）分別洗滌，最后用鹽酸解吸。解吸液分別用717陰離子交換樹脂及732陽(yáng)離子交換樹脂處理，pH調(diào)到左右，冷凍干燥得ACTH。（3）檢驗(yàn)方法：粗品用小白鼠胸腺萎縮法測(cè)定；精品用去垂體大白鼠的腎上腺維生素C降低法測(cè)定。（4）作用與用途：（自己看看）3、降鈣素（Calcitonin,CT）（1）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：是一種調(diào)節(jié)血鈣濃度的多肽激素，由甲狀腺內(nèi)的濾泡旁細(xì)胞（C細(xì)胞）分泌。由32個(gè)氨基酸殘基組成，N-端為半胱氨酸，與7位上的半胱氨酸形成二硫鍵，C-端為脯氨酸。如果去掉脯氨酸，活性盡失。分子量，溶于水和堿性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿等?；盍杀灰鹊鞍酌?、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、多酚氧化酶、H2O2氧化、光氧化及N-溴代琥珀酰亞胺所破壞。降鈣素廣泛存在于多種動(dòng)物體內(nèi)。在人及哺乳動(dòng)物體內(nèi)，主要存在于甲狀腺、甲狀旁腺、胸腺和腎上腺等組織中。（2）生產(chǎn)工藝：（3）工藝過程（略）（4）檢驗(yàn)方法：生物活性測(cè)定法：注射大白鼠，1h后收集血清，測(cè)定血清鈣值（對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定）。（5）作用與用途：（自己看看）第三節(jié)、蛋白質(zhì)類藥物一、主要蛋白質(zhì)類藥物1、蛋白質(zhì)激素（1）垂體蛋白質(zhì)激素生長(zhǎng)素、催乳激素、促甲狀腺素、促黃體生成素、促卵泡激素等（2）促性腺激素人絨毛膜促性腺激素（HCG）、絕經(jīng)尿促性腺激素（HMG）、血清性促性腺激素（SGH）（3）胰島素及其他蛋白質(zhì)激素胰島素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素2、血漿蛋白如白蛋白、纖維蛋白原、凝血因子等

3、蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子如干擾素、IL、NGF、HGF、EPO等4、粘蛋白如胃膜素、硫酸糖肽等5、膠原蛋白如明膠、阿膠等6、堿性蛋白質(zhì)如硫酸魚精蛋白7、蛋白酶抑制劑如胰蛋白酶抑制劑、大豆胰蛋白酶抑制劑等8、植物凝集素如PHA、ConA等二、主要蛋白質(zhì)類藥物的制備（一）白蛋白1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)白蛋白為單鏈多肽，由575aa組成，65KDa，，可溶于水和半飽和硫酸銨溶液；對(duì)酸較穩(wěn)定；加入NaCl可提高其熱穩(wěn)定性。從人血漿中分離的白蛋白有兩種制品：一是從健康人血漿中分離制備的，稱為血清白蛋白；另一是從孕婦胎盤血中制備的，稱胎盤血白蛋白。血漿白蛋白制劑是淡黃色略粘稠的澄清液體或白色疏松狀（凍干）固體。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線（2）工藝過程①絡(luò)合（利凡諾沉淀）人血漿在攪拌下用碳酸鈉溶液調(diào)，再加入等體積2%利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢韬箪o置2-4h，分離上清和沉淀（上清可供生產(chǎn)人丙種球蛋白）。②解離沉淀溶于蒸餾水，用0.5MHCl調(diào)pH到弱酸性，加0.15%-0.2%的NaCl，不斷攪拌解離。③加溫充分解離后，加熱到65℃恒溫1h，立即冷卻。④分離冷卻液離心，離心液再壓濾，得澄清液。⑤超濾澄清液用超濾器濃縮。⑥熱處理濃縮液在60℃恒溫處理10h。⑦澄清和除菌壓濾澄清，再用冷滅菌系統(tǒng)滅菌。⑧分裝檢查合格后分裝。3、檢驗(yàn)方法：顏色、溶解時(shí)間、水分、pH、白蛋白含量、殘余硫酸銨含量、無(wú)菌試驗(yàn)、安全性試驗(yàn)等。

4、作用與用途（略）（二）干擾素1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)是一類細(xì)胞因子，有提高免疫力功能，分為α、β、γ三型，同一型別，根據(jù)氨基酸的序列差異，又可分為若干亞型；三種型別的干擾素的理化和生物學(xué)性質(zhì)有差異，具體見p311表13-8。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線（有從血漿白細(xì)胞中分離的方法和基因工程的方法）（2）工藝過程①分離灰黃層取健康人血液，離心分離，吸取灰黃色層，置4℃冰箱。②氯化銨處理灰黃色層為白細(xì)胞層，用0.83%氯化銨處理，以除去殘存的紅細(xì)胞。用培養(yǎng)液培養(yǎng)，記數(shù)并細(xì)胞密度調(diào)為107個(gè)/ml。③啟動(dòng)誘生加入白細(xì)胞干擾素，終濃度為100u/ml，置37℃水浴培養(yǎng)2h。④正式誘生加入仙臺(tái)病毒，終濃度為100-150血凝單位/ml，在37℃攪拌培養(yǎng)過夜。⑤收獲次日晨將培養(yǎng)物離心，上清液即是粗制干擾素。⑥純化粗制品中加入KSCN至，用HCl調(diào)；離心，棄上清；沉淀加冷乙醇，離心、棄沉淀；上清用HCl調(diào)，離心，上清和沉淀分別處理均可得干擾素純品。3、檢驗(yàn)方法效價(jià)測(cè)定法（見p313）4、作用與用途（p313，自己看看）（三）胰島素1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)由51aa組成，有A、B兩條鏈；A鏈含21個(gè)氨基酸，B鏈含30個(gè)氨基酸；兩條鏈之間由兩個(gè)二硫健相連，在A鏈內(nèi)還有一條二硫?。灰葝u素的同源性很高。胰島素原是一條鏈，加工去掉一段C肽，形成三個(gè)二硫健后，即成為有活性的胰島素。胰島素的性質(zhì)有：①白色結(jié)晶粉末；②分子量