市場營銷第七節(jié)抗體分子的改造和基因工程

第七節(jié)抗體分子的改造和基因工程自1975年Catton和Milstein等研究制造出單克隆抗體（MAb）技術以來，獲得了迅速的發(fā)展和極為廣泛的應用。但也確實存在不少難以克服的問題，如絕大多數(shù)的Mab是鼠源性的，對人有較強的免疫原性。如果用于人的治療，不出2周就會產(chǎn)生人對鼠血清的免疫應答，患者體內(nèi)存在的人抗鼠抗體（humananti-mouseantibody,HAMA），不僅降低了療效，嚴重的可引起患者出現(xiàn)血清病。隨著分子遺傳學、生物化學、特別是分子生物學的發(fā)展，人們開始著手利用DNA分子重組技術，改造和生產(chǎn)所需要的特異性單鏈抗體、免疫粘連素、超變區(qū)多肽，直到用絲狀噬菌體表面呈現(xiàn)技術構建和篩選抗體基因文庫。一、雙特異性抗體免疫球蛋白分子具有重鏈、輕鏈組成的4條肽鏈結構，它們共同組成2個抗原結合點。由于2個結合點的抗原特異性相同，故表現(xiàn)為單一特異性。雙特異性抗體是將2個結合點表現(xiàn)為不同的特異性，抗體的一個結合點的特異性表現(xiàn)為靶細胞（如腫瘤細胞）結合，另一結合點可與藥物（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細胞毒性細胞）結合。這種雙特異性的結合，可使作用物直接地、高密度地作用于靶細胞，提高了療效，從而可相對地減少對患者的副作用。制備雙特異性抗體的方法主要有3種方法：

（1）雜化雜交瘤技術：將具有某種特異性（如抗瘤細胞）的Mab細胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾細胞進行融合，即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細胞株的二價瘤體。它們分泌的是重鏈、輕鏈被雜化的抗體分子，有10種形式：重鏈、輕鏈都無改變，保持原特異性的配對抗體分子：LH-HL，KG-GK重鏈特異性相同的配對抗體分子：LH-HK，KH-HKKG-GL，LG-GL重鏈、輕鏈特異性不同的配對抗體分子：LH-GK，LH-GLKH-GL，KH-GK在這些雜化抗體分子中，只有LH-GK配對的才是所需的雙功能抗體分子。（2）化學交聯(lián)法：Nisonoff和Rivers最早從事這方面的研究?；瘜W交聯(lián)的方法無需經(jīng)過細胞融合，所以比較簡便易行。通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結合在一起?；蛴秒p功能交聯(lián)劑，如鄰苯酸酯等，把兩個抗體半分子交聯(lián)在一起。

用于制備雙雙功能抗體體的Mab可以是完完整分子，，也可是經(jīng)經(jīng)胃酶水解解獲得F（（abˊ））2片段。。后者在減減少鼠源免免疫原性方方面，效果果較好。（3）利用用基因工程程技術將兩兩套重輕鏈鏈基因導入入骨髓瘤細細胞或傳染染瘤細胞中中。這種方法制制備的雙功功能抗體可可選擇合適適的穩(wěn)定區(qū)區(qū)和合適的的類及亞類類，而得到到較好的產(chǎn)產(chǎn)量較高的的雙功能抗抗體。由于于只有較少少的嵌合導導入并整合合到宿主基基因組，故故傳染瘤細細胞更為穩(wěn)穩(wěn)定，染色色體不易丟丟失二、嵌合抗抗體在腫瘤治療療中，帶有有抗瘤藥物物或同位素素等的抗體體具有導向向作用，從從而可定位位診斷或定定向殺傷腫腫瘤細胞。。為解決鼠源源免疫Mab免疫原原性這一難難題，人們們又設計了了小鼠-人人工嵌合抗抗體（chimerieantibody））的新型抗抗體。其原理是取取某一Mab基因的的V區(qū)，與與人Ig基基因的C區(qū)區(qū)連接，然然后插入到到表達質粒粒中，傳染染骨髓瘤細細胞即產(chǎn)生生出鼠-人人嵌合抗體體。由于Ig的的C區(qū)是人人源的，這這種抗體對對人的免疫疫性就大為為降低，采采用不亞類類的人C區(qū)區(qū)基因，便便可改變抗抗體的效應應功能，以以獲抗腫瘤瘤的最佳效效果。鼠-人嵌合合抗體并不不能徹底清清除鼠源免免疫原性，，于是進一一步提出重重構抗體的的設想。即：人化抗抗體三、人化抗抗體抗體的抗原原結合區(qū)域域（V）與與空間結構構主要由抗抗體V區(qū)中中3個CDRS（互補決決定區(qū)）所決定，所所以這一抗抗體的構建建是用原鼠鼠IgV區(qū)區(qū)中的CDR區(qū)插入入到人IgV的框架架區(qū)。這樣構建成成的重組分分子既保留留了結合抗抗原的功能能，又消除除了鼠源的的免疫原性性。這類人人化抗體（（humanhizedantibodies）也可可稱為重構構抗體。為了構建這這類抗體，，首先需要要測出MabV區(qū)的的核苷酸序序列，根據(jù)據(jù)其中的CDRS序列，用全全合成或點點突變的方方法將人Ig重構成成MabV區(qū)的CDRS序列列，然后將將這種重構構的V區(qū)基基因與人IgC區(qū)基基因連接，，構成完整整的人Ig基因，再再于骨髓瘤瘤細胞內(nèi)表表達。四、單鏈抗抗體用一編碼親親水易折疊疊多肽的人人工合成寡寡核苷酸，，將重鏈V區(qū)（3ˊˊ）與輕鏈鏈V區(qū)（5ˊ）端連連接在一起起（VH-linker-VL）即成成單鏈抗體體基因，將將此基因克克隆入原核核或真核表表達載體中中，在原核核或真核系系統(tǒng)中表達達出的蛋白白質即為單單鏈抗體（（singlechainantibodies））。它能自發(fā)折折疊成天然然構象，與與抗原的結結合力維持持與原來完完整抗體一一樣。五、免疫粘粘連素把細胞受體體或細胞間間粘附分子子（intercellularadhesionmolcule,ICAM）與Ig的Fc段相連，，即為免疫疫粘連素（（immunoadhesin）。Staunton等等制成一種種含有可溶溶性細胞內(nèi)內(nèi)粘附分子子-1（1CAM-1）的免免疫粘連素素，它能有有效地和特特異的抑制制被惡性瘧瘧原蟲感染染的紅細胞胞對能產(chǎn)生生1CAM-1表面面的粘附。。當被感染染的紅細胞胞與上述免免疫粘連素素結合后，，F(xiàn)c片段段可促使單單核細胞的的吞噬作用用。這種抗體可可用于惡性性瘧疾的治治療。T細胞表面面抗原CD4是愛滋滋病病毒（（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）的受體體，在免疫疫預防和免免疫治療方方面，免疫疫粘連素可可能會提供供一個新的的途徑。將Ig的Fc段與CD4形成成的重組分分子，可以以中和HIV，但只只是簡單地地結合會引引起具Fc受體細胞胞的感染，，而在體內(nèi)內(nèi)具有Fc受體的細細胞相應是是多的，為為此只有用用定點突變變或其他方方法改變Fc段，使使之不與Fc受體結結合，便可可有效地防防治愛滋病病。六、抗體基基因文庫的的構建和基基因表達篩篩選的表面面呈現(xiàn)技術術1985年年Smith將一基基因片段克克隆到載體體噬菌體fd-tet的基因因Ⅲ（g3）上，發(fā)發(fā)現(xiàn)該基因因所表達的的蛋白與噬噬菌體基因因Ⅲ表達的的蛋白結合合在一起呈呈現(xiàn)到噬菌菌體表面。。這種表達達的融合蛋蛋白仍保留留抗原特異異性和生物物活性，可可通過相應應抗原進行行檢測。這樣我們不不僅可以利利用噬菌體體來構建基基因文庫，，而且可以以獲得表達達性的基因因文庫，無無疑對高效效率地篩選選和富集目目的基因提提供了極大大的方便?！，F(xiàn)在這一技技術已被廣廣泛地用于于抗體基因因文庫，cDNA文文庫、隨機機多肽基因因文庫和突突變基因文文庫的構建建和篩選等等諸多方面面。絲狀噬菌體體表面呈現(xiàn)現(xiàn)技術以絲絲狀噬菌體體為表達載載體，目的的基因插入入到噬菌體體外殼蛋白白基因內(nèi)，，其天達產(chǎn)產(chǎn)物呈現(xiàn)在在噬菌體表表面。Ff絲狀噬噬菌體Ff絲狀噬噬菌體呈柔柔性長絲狀狀，直徑約約為6.5nm,野野生型體長長約為900nm。。其基因組組是一單鏈鏈環(huán)狀DNA，全序序列已經(jīng)測測也，約含含6000多個核苷苷酸，編碼碼10種蛋蛋白質。其其中有5種種蛋白組成成外殼蛋白白，基因ⅧⅧ（g8））在野生型型噬菌體中中約有2700～3000個個考貝，它它所編碼的的gp8蛋蛋白是外殼殼蛋白的主主要成分。。它圍繞基基因組DNA以螺旋旋對稱的排排列構成圓圓管形的噬噬菌體外殼殼。除gp8外，不不有4種少少量的外殼殼蛋白：gp3、gp6、gp7和gp9，分分別由基因因Ⅲ、Ⅵ、、Ⅶ、Ⅸ編編碼，它們們各有5個個拷貝。目的基因表表達的蛋白白如若想在在噬菌體表表面呈現(xiàn)，，就必須插插在這5種種外殼的其其中這一處處。實驗表表明，在gp6、gp7、gp9中插插入外源蛋蛋白，都會會影響其構構成外殼蛋蛋白的功能能，而在gp8和gp3的N端插入外外源蛋白后后，形成的的融合蛋白白既可在噬噬菌體表面面呈現(xiàn)，也也不影響噬噬菌體的完完整性和穩(wěn)穩(wěn)定性。成熟的gp8含有50個氨基基酸，從構構成外殼的的功能來看看可分為4個部分：：（1）C端端15個氨氨基酸偏堿堿性，與DNA相結結合，構成成外殼的內(nèi)內(nèi)壁，在此此處的突變變將影響與與DNA的的相互作用用。（2）25～35位位肽段具有有高度的疏疏水性，借借此特性分分子間相互互聚合，形形成固牢的的外殼。這這段肽鏈的的改變將會會影響噬菌菌體結構的的穩(wěn)定性。。（3）從第第6位的脯脯氨酸到C末端是連連續(xù)的α螺螺旋結構，，6～24位的螺旋旋肽段外露露，在外殼殼上排列緊緊密，占據(jù)據(jù)了噬菌體體的大部分分表面。如如有稍大肽肽段插入，，將會影響響外殼的穩(wěn)穩(wěn)定性。（4）N端端1～5位位的氨基酸酸序列是丙丙氨酸-谷谷氨酸-甘甘氨酸-門門冬氨酸-門冬氨酸酸（A-E-G-D-D），，它外露于于噬菌體表表面，是外外源肽段插插入的最佳佳位置。利用這一系系統(tǒng)可以構構建表達性性基因文庫庫，稱為噬噬菌體呈現(xiàn)現(xiàn)文庫。它它最先被用用于抗體基基因文庫的的構建和篩篩選。雖然然利用動物物的免疫可可以獲得循循環(huán)多克隆隆抗體，用用細胞融合合方法可以以獲得單克克隆抗體，，但利用基基因工程的的技術構建建抗體基因因庫，再篩篩選所需的的特異性抗抗生，不僅僅擺脫了繁繁重的工作作量，也可可獲得大量量的、穩(wěn)定定的抗體。。而且隨著著研究的不不斷深入和和發(fā)展，抗抗體的多樣樣性，親和和力也大有有提高。在構建噬菌菌體呈現(xiàn)抗抗體文庫技技術中，主主要有3個個特點：（1）可用用抗原制備備出免疫吸吸附劑，將將文庫的噬噬菌體與其其反應，再再經(jīng)洗滌、、洗脫得以以捕獲和純純化，將這這種表達所所需的特異異性抗體的的噬菌體感感染大腸桿桿菌而得到到繁殖。如如此經(jīng)過親親和結合→→洗滌→洗洗脫→繁殖殖的富集過過程，稱為為“panning”（淘選選），一輪輪paning便可可富集1000倍。。如此簡便便、高效率率，是其他他方法比似似的。（2）親和和力成熟過過程可由體體內(nèi)轉為體體外。如前前所述，抗抗原物質對對動物機體體的再次免免疫，可獲獲得高親和和力的抗體體。這種在在體內(nèi)出現(xiàn)現(xiàn)的親和力力成熟的現(xiàn)現(xiàn)象，是由由于細胞抗抗體基因在在CDRS區(qū)域突變變，再通過過表面呈現(xiàn)現(xiàn)技術加篩篩選，便可可獲得親和和力的特異異抗體（3）這種種方法不僅僅可以獲得得單鏈抗體體，也可制制備出重鏈鏈、輕鏈結結合的抗體體（Fab）片段。。外源基因編編碼的肽段段在融合蛋蛋白的N端端，呈現(xiàn)在在噬菌體表表面時，C端錨著在在膜上，N端是游離離的，能夠夠正確折疊疊，也可以以形成二硫硫鏈。如果在插入入基因與編編碼成熟gp8序列列間放置amber終止碼（（TAG）），則TAG就是蛋蛋白質合成成的終止信信號，合成成的多肽以以非融合蛋蛋白的形式式分泌在內(nèi)內(nèi)膜與細胞胞壁間的周周質中，進進而還能進進入培養(yǎng)基基中。利用用這些特性性，可將Fc蛋白錨錨著于細胞胞膜上，在在周質中的的分泌的輕輕鏈分子可可與重鏈原原位組裝。。形成完整整的Fab片段積累累在膜表面面。9、靜夜四無無鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Saturday,December31,202210、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。08:19:3408:19:3408:1912/31/20228:19:34AM11、以以我我獨獨沈沈久久，，愧愧君君相相見見頻頻。。。。12月月-2208:19:3408:19Dec-2231-Dec-2212、故人江江海別，，幾度隔隔山川。。。08:19:3408:19:3408:19Saturday,December31,202213、乍見翻疑疑夢，相悲悲各問年。。。12月-2212月-2208:19:3408:19:34December31,202214、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國見見青山。。。31十十二月20228:19:34上午午08:19:3412月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月228:19上上午12月-2208:19December31,202216、行動出成果果，工作出財財富。。2022/12/318:19:3408:19:3431December202217、做做前前，，能能夠夠環(huán)環(huán)視視四四周周；；做做時時，，你你只只能能或或者者最最好好沿沿著著以以腳腳為為起起點點的的射射線線向向前前。。。。8:19:35上上午午8:19上上午午08:19:3512月月-229、沒沒有有失失敗敗，，只只有有暫暫時時停停止止成成功功?。?。。12月月-2212月月-22Saturday,December31,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有結結果果，，但但是是不不努努力力卻卻什什么么改改變變也也沒沒有有。。。。08:19:3508:19:3508:1912/31/20228:19:35AM11、成功就是是日復一日日那一點點點小小努力力的積累。。。12月-2208:19:3508:19Dec-2231-Dec-2212、世間成成事，不不求其絕絕對圓滿滿，留一一份不足足，可得得無限完完美。。。08:19:3508:19:3508:19Saturday,December31,202213、不知香積寺寺，數(shù)里入云云峰。。12月-2212月-2208:19:3508:19:35December31,202214、意志堅強強的人能把把世界放在在手中像泥泥塊一樣任任意揉捏。。31十二二月20228:19:35上上午08:19:3512月-2215、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荊荊門門九九派派通通。。。。。十二二月月228:19上上午午12月月-2208:19December31,202216、少年十十五二十十時，步步行奪得得胡馬騎騎。。2022/12/318:19:3508:19:3531December202217、空山新新雨后，，天氣晚晚來秋。。。8:19:35上午午8:19上午午08:19:3512月-229、楊柳柳散和和風，，青山山澹吾吾慮。。。12月月-2212月月-22Saturday,December31,202210、閱讀一切切好書如同同和過去最最杰出的人人談話。08:19:3508:19:3508:1912/31/20228:19:35AM11、越越是是沒沒有有本本領領的的就就