高效液相色譜法正式版

第16章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography16-1概述16-1-1高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）又稱高壓液相色譜法或高速液相色譜法，是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種以液體做流動相的新的柱色譜技術(shù)。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備分離效率高、檢出限低、靈敏度高、分析速度快、操作自動化的特點。目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。16-1-2液相色譜分離原理及分類1.液相色譜分離原理：液相色譜的分離系統(tǒng)也由兩相-固定相和流動相組成。被分離混合物由流動相液體推動進(jìn)入色譜柱中。根據(jù)各組分在固定相及流動相中吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。2.色譜分離的實質(zhì)色譜分離的實質(zhì)是樣品分子與溶劑（流動相或洗脫液）及固定相分子間的作用力，作用力的大小決定色譜過程的分離（保留）行為。2.液相色譜的分類吸附色譜分配色譜離子交換色譜體積排阻色譜法親和色譜依據(jù)樣品組分在固定相上的吸附性能差異實現(xiàn)分離的。依據(jù)樣品組分在流動相和固定相之間的分配性能差異實現(xiàn)分離的。依據(jù)樣品中離子與固定相上的電荷基團(tuán)進(jìn)行可逆性離子交換的能力的差異實現(xiàn)分離的。依據(jù)樣品組分的分子尺寸不同實現(xiàn)分離的。主要用于生化分析，固定相含有能與生物分子可逆結(jié)合以及解離的配基（配體），如生物分子（抗原）與配體（抗體）之間的特異性相互作用不同而實現(xiàn)分離的。1.高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較①經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻，常壓輸送流動相，柱效低（H↑，n↓）分析周期長，無法在線檢測。②HPLC：分離和分析，柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱），高壓輸送流動相，柱效高（H↓，n↑），分析時間大大縮短，可以在線檢測。16-1-3液相色譜與經(jīng)典液相色譜、氣相色譜的比較2.高效液相色譜法與氣相色譜法的比較①LC和GC的共性色譜基本概念與術(shù)語、色譜基本理論、基本關(guān)系式及定性定量方法對于高效液相色譜同樣適用。

影響柱效的因素同樣為渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力三項。②兩者具有很大的互補性互補性：低沸點—高沸點。

③兩者的差異a.分析對象（兩者應(yīng)用范圍不同）GC:能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，對高沸點，熱不穩(wěn)定，離子型化合物及高聚物的分離分析較困難。20%有機物能采用氣相色譜分析。HPLC：溶解后能制成溶液的樣品；不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、不易揮發(fā)或熱穩(wěn)定性差、高分子及離子型樣品均可檢測；用途廣泛，有機物的80%能采用HPLC進(jìn)行分析。b.流動相差別GC：流動相為惰性氣體，氣相色譜的流動相僅起運載作用，對組分不產(chǎn)生相互作用力，組分只與固定相作用。HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用，流動相種類較多，選擇余地廣。c.操作條件差別d.制備分離LC在制備分離上，有很廣泛的應(yīng)用。但高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格，而且缺乏通用的檢測器，這是它的主要缺點。GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?.液相色譜柱效Giddings提出的液相色譜速率方程如下：H=He+Hd+Hs+Hm+Hsm

H為塔板高度；He，Hd，Hs，Hm，Hsm

分別為渦流擴(kuò)散項、縱向擴(kuò)散項、固定相傳質(zhì)阻力、流動相傳質(zhì)阻力、滯留流動相傳質(zhì)阻力。（1）He=2λdp,λ載體顆粒的不規(guī)則因子，dp載體粒徑。采用小粒度載體顆粒和提高柱內(nèi)載體填充的均勻度可以提高柱效。（2）Hd=CdDm/u,u為流動相線速度，Cd為常數(shù)，Dm為組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)。液體黏度比氣體大得多，且液相色譜柱溫較低，接近室溫，因此組分在液體中的擴(kuò)散系數(shù)Dm

較小，而當(dāng)u大于1cm/s時，Hd可以忽略。（3）Hs=Cs’df2u/Ds,Cs’與分配比k’有關(guān)的系數(shù)，df為固定液液膜厚度，Ds為組分在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)，因此，可以通過改善傳質(zhì)過程，加快組分分子在固定相上的解吸過程來提高柱效。對液液分配色譜，可以使用較薄的固定相層；對于化學(xué)鍵合相，此項可忽略；對吸附、排阻與離子交換色譜可以使用較小顆粒的填料。（4）Hm=Cm’dp2u/Dm,Cm’與分配比k’有關(guān)，其值取決于柱的直徑、形狀與填料顆粒的結(jié)構(gòu)；Dm為組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)。（5）Hsm=Csm’dp2u/Dm,

Csm’為與顆粒中被流動相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)以及分配比有關(guān)的常數(shù)。小結(jié)：由上可知，填料顆粒小，填充均勻，流動相流速低，H較?。粯悠贩肿映叽缧r，H較??；流動相粘度較低柱溫較高時，H較小。但是有機溶劑作流動相時，增加柱溫產(chǎn)生氣泡；降低流速可以降低傳質(zhì)阻力項，但增加了分析時間。應(yīng)根據(jù)速率方程，對各影響因素予以綜合考慮。16-2高效液相色譜儀高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)組成。圖16-2高效液相色譜儀流程16-2-1高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置、壓力表等組成。1.溶劑貯存器材料：耐腐蝕，可為玻璃，不銹鋼，氟塑料等放置位置：高于泵體，保持一定的靜壓差容積：0.5～2.0L2.高壓輸液泵高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。基本要求：⑴流量準(zhǔn)確可調(diào)，0.1～10ml/min⑵耐高壓，40～50MPa⑶液流穩(wěn)定，無脈動⑷死體積小，要求小于0.5ml分類：⑴恒流泵注射型泵往復(fù)型泵，應(yīng)用最廣泛⑵恒壓泵：氣動泵3.梯度洗脫裝置梯度洗脫：在分離過程中，使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH或離子強度相應(yīng)地變化，以達(dá)到提高分離效果，縮短分析時間的目的。又稱高壓梯度，利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱，具有流量精確度高和梯度洗脫曲線重現(xiàn)性好的特點。又稱低壓梯度，通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例混合，再用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，價格便宜。內(nèi)梯度裝置：外梯度裝置：圖16-3外梯度和內(nèi)梯度示意圖內(nèi)梯度外梯度16-2-2進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等。通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如下圖所示：16-2-3分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等?！糁牧希翰讳P鋼作色譜柱柱管◆柱規(guī)格：柱管內(nèi)徑為2～6mm長：10～50cm；填料粒度：5～10μm16-2-4檢測器溶質(zhì)性檢測器總體檢測器它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)。如：紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)。如示差折光，電導(dǎo)檢測器等高效液相色譜要求檢測器靈敏度高，重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，對溫度流量的變化不敏感，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。包括：紫外吸收檢測器，示差折光檢測器，熒光檢測器，極譜檢測器，電導(dǎo)檢測器以及氫火焰離子化檢測器等。

1.紫外吸收檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。特點：靈敏度高，線性范圍寬；對流動相的流速和溫度變化不敏感，適用于梯度洗脫；波長可選，易于操作。原理：基于被分析試樣對特定波長紫外和可見光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關(guān)系服從朗伯比爾定律。2.光電二極管陣列檢測器：由光源發(fā)出的紫外或可見光通過檢驗池，所得組分的特征吸收的全部波長經(jīng)光柵分光、聚焦到二極管陣列上同時被檢測，計算機快速采集數(shù)據(jù)，便得到三維時間-色譜-光譜圖。3.示差折光檢測器：利用樣品池中溶液折射率的變化，以測定流動相中樣品的濃度。4.熒光檢測器：在一定波長的光（樣品的最佳激發(fā)波長，一般相當(dāng)于其最大吸收波長）的激發(fā)下能發(fā)射熒光的化合物或能用柱前或柱后衍生法制成熒光衍生物的物質(zhì)均可進(jìn)行熒光檢測。16-3液固吸附色譜法液固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。16-3-1吸附機理當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子（S）。同時，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓肿樱谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附。

Xm+nSads=Xads+nSm

下標(biāo)m、ads分別表示流動相和固定相，n是吸附X分子所需解吸的S分子數(shù)目。達(dá)到吸附平衡時，吸附平衡常數(shù)（K）可表示為：其中K為吸附平衡常數(shù)，K值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。K值小，則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。K值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。16-3-2液固色譜固定相固定相：極性：非極性：活性炭酸性吸附劑：硅膠、硅酸鎂。適合分離堿性溶質(zhì)，如脂肪胺與芳香胺。堿性吸附劑：氧化鋁、氧化鎂、聚酰胺。適合分離酸性溶質(zhì)，如酚，羧酸與吡咯衍生物。注：最常使用的吸附劑是硅膠，其次為氧化鋁。16-3-3液固色譜流動相流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。1.流動相的基本要求：（1）能溶解被分離的樣品，但不與樣品反生反應(yīng)；（2）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)（3）與所用檢測器相匹配，如利用紫外檢測器時，溶劑要不吸收紫外光；（4）粘度盡可能小，以獲得高的滲透性與柱效；（5）價格便宜、毒性小、不易著火，易于精制純化。2.流動相的選擇原則：極性大的試樣用極性較強的流動相；極性弱的試樣則用極性弱的流動相。3.分析對象：適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。16-4液液色譜法（分配色譜法）16-4-1分離原理固定相與流動相均為液體（互不相溶）。1.分離原理

液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。K=k’Vm/Vs所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。16-4-2固定相固定相載體固定液表面多孔型載體全多孔型載體全多孔型粒子載體β,β’-氧二丙腈聚乙二醇十八烷角鯊?fù)槿秉c：由于固定液是機械涂漬在載體上的，在流動相中會產(chǎn)生微量溶解，在流動相連續(xù)通過色譜柱的機械沖擊下，固定液會不斷地流失，而流失的固定液又會污染已被分離開的組分?？朔k法：直接用化學(xué)方法把有機分子鍵合到載體或硅膠表面上而制成的新型固定相－化學(xué)鍵合固定相，不僅解決了固定相的流失問題，而且使固定相的功能得到了改善。16-4-3流動相要求：對固定相的溶解度盡可能小。對于親水性固定液，應(yīng)選擇疏水性流動相；反之，相反。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜?！粽喾峙渖V：流動相的極性<固定液的極性適用于極性化合物的分離極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱◆反相分配色譜：流動相的極性＞固定液的極性適用于非極性化合物的分離極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱16-5化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法：在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行物質(zhì)分離的一種液相色譜方法。16-5-1化學(xué)鍵合固定相用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機物或有機硅化合物可成鍵,即可得到各種性能的固定相。1.鍵合固定相類型

硅酸酯型：≡Si—O—C≡硅氮型：≡Si—N=硅碳鍵型：≡Si—C≡硅氧烷型：≡Si—O—Si—

C≡其中，硅氧烷型鍵合相熱穩(wěn)定性好，不易吸水，耐有機溶劑，能在70℃以下，pH在2～8范圍內(nèi)正常工作，是目前應(yīng)用最廣泛的鍵合相。2.化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面沒有液坑。（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水，耐光，耐有機溶劑，穩(wěn)定。（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性。（5）有利于梯度洗脫。存在著雙重分離機制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定)高覆蓋率：分配為主；

低覆蓋率：吸附為主。

16-5-2反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合固定相（硅膠-C18H37,硅膠-苯基等）流動相：強極性溶劑如：甲醇/水、乙腈/水水和無機鹽的緩沖溶液反相鍵合相色譜法分離機制：疏溶劑理論(主流理論認(rèn)為是屬于吸附色譜)這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強的疏水特性。L(鍵合烷基)+S(組分分子)LS固定相上的烷基配合基或被分離分子中非極性部分的表面積越大或者流動相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強，容量因子越大，保留值越大。出柱順序：極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱；適用范圍：非極性--中等極性組分（HPLC大約80%采用反相完成）

締合解締正相鍵合相色譜法固定相：極性鍵合固定相流動相：如硅膠-CN，硅膠-NH2，硅膠-二醇基16-5-3正相鍵合相色譜法非極性或弱極性有機溶劑＋適量的有機極性調(diào)節(jié)劑（氯仿、醇、乙腈等）分析對象:分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別是用于分離不同類型的化合物。一般認(rèn)為正相色譜的分離機制屬于分配色譜。其k’隨著固定相極性增加而增大，隨流動相極性增加而降低；極性鍵合相的極性越大，組分保留時間越大。16-5-4離子性鍵合相色譜法

當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H、一CH2NH2、－C00H、一CH2N(CH3)3Cl等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。小結(jié)：化學(xué)鍵合相色譜法的優(yōu)點是：①適用于分離幾乎所有類型的化合物；②由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度洗脫。③最大缺點是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。④柱效高、使用周期長、分析重現(xiàn)性好。16-6離子交換色譜法離子交換色譜以離子交換樹脂為固定相，樣品組分離子與樹脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換。根據(jù)組分離子對樹脂親和力不同而得到分離。其交換過程如下：16-6-1分離原理

陽離子交換：

陰離子交換：

橫線表示在固定相上，Z+與X-代表被分析的組分離子；M+與Y-表示樹脂上可交換的離子團(tuán)。達(dá)平衡時，以濃度表示交換反應(yīng)的平衡常數(shù)分別為：

陽離子交換：

陰離子交換：

平衡常數(shù)K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強，越易保留而難于洗脫。一般說來，組分離子電荷越大，水合離子半徑越小，K值就越大。16-6-2固定相固定相：陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂。對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的選擇性順序按以下順序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+

二價離子的順序為：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+

對于季胺型強堿陰離子交換樹指，陰離子的選擇性順序為：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－（l）多孔型離子交換樹脂主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分[見圖21-12中（a）和（b）］。（2）薄膜型離子交換樹脂直徑約對30μm的固體情性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層，如圖中（c）。（3）表面多孔型離子交換樹脂在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂，如圖中（d）所示。（4）離子交換鍵合固定相用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。常用的離子交換劑固定相可分以下幾種：16-6-3流動相流動相：大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。陰離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制K值，改變選擇性。

16-6-4應(yīng)用凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機和生物物質(zhì)的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。16-7空間排阻色譜法16-7-1分離原理分離原理：立體排阻，按分子大小順序進(jìn)行分離。體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。排阻極限:比A點相應(yīng)的相對分子質(zhì)量大的分子,均被排斥于所有的膠孔之外。滲透極限:比B點相應(yīng)的相對分子質(zhì)量小的分子都可以完全滲入凝膠孔穴中。相對分子質(zhì)量介于排阻極限和滲透極限之間的化合物，將根據(jù)它們的分子尺寸，進(jìn)入一部分孔穴，而不能進(jìn)入另一部分孔穴，其結(jié)果使這些化合物按相對分子質(zhì)量降低的次序被洗脫。因此，在選擇固定相時，應(yīng)使欲分離試樣粒子的相對分子質(zhì)量落在固定相的排阻極限和滲透極限之間。排阻色譜的特點:1.保留時間是分子尺寸的函數(shù),因此有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息；2.保留時間短，譜峰窄，容易檢測，可以用靈敏度較低的檢測器；3.固定相與分子間的作用力弱，趨于零，即柱子不能很好地保留分子，因此柱壽命長；4.不能分辨分子大小相近的化合物．一般來說，分子量的差別需在10%以上時才能得到分離。16-7-2排阻色譜的填料和流動相1.固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)。一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。凝膠：指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠，它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。2.流動相流動相特點：①必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠；②溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴(kuò)散作用而影響分離效果。③選擇溶劑還必須與檢定器相匹配?！舫Ｓ玫牧鲃酉嘤兴臍溥秽?、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。16-7-3應(yīng)用分為凝膠過濾和凝膠滲透兩類，主要用于分離大分子物質(zhì)，其分離范圍為相對分子質(zhì)量2000-2000000。1.根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇

相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質(zhì)量范圍是200～2000。對于相對分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用空間排阻法為最佳。2.根據(jù)溶解度選擇3.根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇水溶性試樣最好用離子交換色譜法或液液分配色譜法。微溶于水的但在酸堿存在下能很好解離的可用離子交換色譜法。油溶性或相對非極性混合物可用液固色譜法。離子型化合物可用離子交換色譜。異構(gòu)體可用液固色譜。不同官能團(tuán)化合物可用液液分配色譜法。高分子聚合物可用空間排阻色譜法。16-8色譜分離方法的選擇選擇色譜分類方法的主要根據(jù)是試樣的相對分子質(zhì)量的大小、在水中和有機溶劑的溶解度、極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)。

1937年，蒂塞利烏斯(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白。發(fā)現(xiàn)試樣的遷移速率和方向由其電荷和淌度決定。獲1948年諾貝爾化學(xué)獎。16-9毛細(xì)管電泳（CE）電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。電泳法：利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。

按形狀分類：U形管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳。傳統(tǒng)電泳分析缺點：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。

高效毛細(xì)管電泳：以高壓直流電場為驅(qū)動力、以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)試樣組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離、分析的新型液相分離技術(shù)。電泳淌度μ：單位電場強度下的平均電泳速度。淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，理論塔板數(shù)高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——高效毛細(xì)管電泳(HPCE)。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進(jìn)：

一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓?！裘?xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高?！綦妷荷?，電場推動力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加，◆高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。16-9-1基本原理1.毛細(xì)管電泳的裝置高壓電源、帶有冷卻裝置的毛細(xì)管、進(jìn)樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、兩個貯液器和控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。毛細(xì)管電泳裝置①毛細(xì)管材料：石英；規(guī)格：內(nèi)徑20～100μm，外徑350～400μm；長度<=1m②高壓電源一般為0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；且電源極性易轉(zhuǎn)換。高壓電源為分離提供動力的；③進(jìn)樣方式進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-2%；納升級、非常小；a.壓差法（1）進(jìn)樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進(jìn)樣b.電遷移法將毛細(xì)管進(jìn)口端和高壓電極一起插入試樣溶液，接通高壓（5KV）,控制時間，靠電滲流可定量地引入試樣。④.檢測器要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測。

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15

加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導(dǎo)10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置質(zhì)譜10-17～10-16⑤緩沖液池化學(xué)惰性，機械穩(wěn)定性好；2.分離原理電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象（前文已解釋）和電滲流現(xiàn)象。①電滲流現(xiàn)象：毛細(xì)管成分為SiO2,與水接觸生成硅羥基-Si-OH，當(dāng)電解質(zhì)溶液的pH大于等于3時，硅羥基發(fā)生解離，形成-Si-O-

，使毛細(xì)管內(nèi)壁表面帶負(fù)電荷，因此它會吸引電介質(zhì)中的陽離子，形成雙電層。在高壓作用下，雙電層中的水合陽離子將攜帶附近的溶液一起向陰極方向流動，形成電滲流。帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)緩沖溶液中的遷移速度等于電泳與電滲流二者的矢量和。電滲速率：電滲流遷移的速率。②電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽極；石英毛細(xì)管：帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極。③HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。帶電粒子的遷移速率=電泳+電滲流，兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運動方向一致，在負(fù)極最先流出陰離子：兩種效應(yīng)的運動方向相反。v電滲流>v電泳時，陰離子隨電滲流在負(fù)極最后流出。在這種情況下，不但可以按類分離，除中性粒子外，同種類離子由于受到的電場力大小不一樣導(dǎo)致差速遷移被相互分離?？偟膩碚f，毛細(xì)管電泳實現(xiàn)了所有組分的同向泳動，正負(fù)離子的同時分離。中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出，中性粒子之間不能分離；

④石英毛細(xì)管：帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極。（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；因此：（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。改變電滲流方向的方法：1）毛細(xì)管改性表面鍵合陽離子基團(tuán)；2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽極。3.高效毛細(xì)管電泳的特點①儀器簡單、易自動化②分析速度快、分離效率高電源、毛細(xì)管、檢測器、溶液瓶在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子（堿金屬與鑭系元素）；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)；③操作方便、消耗少；操作模式多