第八章工業(yè)微生物代謝控制育種

第七章工業(yè)微生物代謝控制育種代謝控制發(fā)酵

以生化和遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，研究代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制，選擇巧妙的技術(shù)路線，通過(guò)遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過(guò)了微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量合成或累積。如氨基酸、核苷酸及某些次級(jí)代謝產(chǎn)物。

工業(yè)生產(chǎn)中的流水線技術(shù)，就是選擇巧妙的技術(shù)路線，環(huán)環(huán)相扣，使得產(chǎn)品的生產(chǎn)效率達(dá)到最大。第一節(jié)概論

代謝控制育種則是要獲得代謝調(diào)節(jié)機(jī)制不完善的高產(chǎn)菌株。

新陳代謝（metabolism）簡(jiǎn)稱代謝，泛指發(fā)生在活細(xì)胞中的各種分解代謝（catabolism）和合成代謝

(anabolism)的總和。分解代謝酶系復(fù)雜分子（有機(jī)物）簡(jiǎn)單分子+ATP

+[H]合成代謝酶系

一、初級(jí)代謝和初級(jí)代謝產(chǎn)物1.分解代謝體系：糖、脂、蛋白質(zhì)

2.素材性生物合成體系：氨基酸、核苷酸

3.結(jié)構(gòu)性生物合成體系：蛋白質(zhì)、核酸、多糖、類脂二、次級(jí)代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物

次級(jí)代謝產(chǎn)物是對(duì)產(chǎn)生它們的生物本身不需要的一種產(chǎn)物。如抗生素、生長(zhǎng)刺激素、生物堿、色素、毒素以及甾體。三、初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的關(guān)系1.從生化代謝方面：葡萄糖碳架摻入途徑；莽草酸途徑；與核苷有關(guān)的途徑；聚酮體和聚丙酸途徑；由氨基酸衍生的途徑；甲羥戊酸途徑；其它復(fù)合途徑。各代謝途徑互相交錯(cuò)，互相影響。2.從遺傳代謝觀點(diǎn)：初級(jí)代謝受核內(nèi)DNA調(diào)控；次級(jí)代謝受核內(nèi)DNA和核外DNA（質(zhì)粒）調(diào)控。第二節(jié)初級(jí)代謝的調(diào)節(jié)控制

微生物細(xì)胞內(nèi)的所有生化反應(yīng)都是在酶的催化下進(jìn)行的，因此對(duì)酶的調(diào)節(jié)控制是主要的、最有效的調(diào)控方式。1.反饋?zhàn)瓒簦赫{(diào)節(jié)酶的合成量。2.反饋抑制：調(diào)節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力。一、酶合成的調(diào)節(jié)

酶合成的調(diào)節(jié)：通過(guò)調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，這是一種在基因水平上的代謝調(diào)節(jié)。（一）酶合成調(diào)節(jié)的類型1、誘導(dǎo)組成酶：細(xì)胞固有的酶類，其合成是在相應(yīng)的基因控制下進(jìn)行，“與生俱來(lái)”。誘導(dǎo)酶：細(xì)胞為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶，“后天學(xué)習(xí)”。（1）同時(shí)誘導(dǎo)：誘導(dǎo)物加入后，微生物能同時(shí)或幾乎同時(shí)誘導(dǎo)幾種酶的合成，主要存在于短的代謝途徑中。（2）順序誘導(dǎo)：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達(dá)到對(duì)復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。2、阻遏

通過(guò)阻遏作用來(lái)阻礙代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產(chǎn)物的合成。末端產(chǎn)物阻遏：由某代謝途徑末端產(chǎn)物過(guò)量累積而引起的阻遏。分解代謝物阻遏：有兩種碳源（或氮源）分解底物存在時(shí)，細(xì)胞利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的低物的有關(guān)分解酶合成的現(xiàn)象。（二）酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制

操縱子：由啟動(dòng)基因（是轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)）、操縱基因（決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄是否能進(jìn)行）和結(jié)構(gòu)基因（轉(zhuǎn)錄翻譯出相應(yīng)的酶）組成。

調(diào)節(jié)蛋白分為阻遏物（能在沒(méi)有誘導(dǎo)物時(shí)與操縱基因相結(jié)合）和阻遏物蛋白（只能在輔阻遏物存在時(shí)才能與操縱基因相結(jié)合）。

誘導(dǎo)型操縱子（乳糖操縱子）阻遏型操縱子（色氨酸操縱子）乳糖操縱子色氨酸操縱子二、酶活性的調(diào)節(jié)前體激活：后面的反應(yīng)被前面的中間產(chǎn)物所促進(jìn)。反饋抑制：末端代謝產(chǎn)物過(guò)量抑制前面的酶活性。（一）反饋抑制的類型1、直線式代謝途徑中的反饋抑制

2、分支代謝途徑中的反饋抑制(1)協(xié)同反饋抑制(2)累積反饋抑制(3)增效反饋抑制(4)順序反饋抑制(5)同工酶調(diào)節(jié)（二）反饋抑制的機(jī)制

受反饋抑制的調(diào)節(jié)酶一般都是變構(gòu)酶，有兩個(gè)活性中心：催化中心調(diào)節(jié)中心變構(gòu)效應(yīng)(協(xié)同效應(yīng))效應(yīng)物＋調(diào)節(jié)中心→構(gòu)象變化→阻礙酶與底物結(jié)合

→酶活變化。三、反饋?zhàn)瓒襞c反饋抑制的比較反饋抑制是通過(guò)調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的活力得以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)椴簧婕暗鞍踪|(zhì)的合成過(guò)程，調(diào)節(jié)的效果比較直接而快速。反饋?zhàn)瓒羰菍?duì)酶合成的阻遏，是基因轉(zhuǎn)錄水平上的代謝調(diào)節(jié)，效果不及反饋抑制那樣迅速。

第三節(jié)次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)控制次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑中，反饋調(diào)節(jié)作用包括：1.次級(jí)代謝產(chǎn)物本身積累就能反饋調(diào)節(jié)作用；2.初級(jí)代謝產(chǎn)物作為次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的前體，當(dāng)其受到反饋調(diào)節(jié)時(shí)，必然會(huì)影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。使調(diào)節(jié)機(jī)制失效，可以提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的代謝和合成包括初級(jí)代謝（菌體生長(zhǎng)期）和次級(jí)代謝階段（合成抗生素的產(chǎn)生期）。次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶在生長(zhǎng)期受阻遏。一、次級(jí)代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)

誘導(dǎo)物→刺激影響初級(jí)代謝造成代謝流的改變→大量生成次生代謝物

誘導(dǎo)物→次生代謝物合成酶的合成→大量生產(chǎn)次生代謝物如：色氨酸誘導(dǎo)刺激麥角堿的產(chǎn)生蛋氨酸對(duì)頭孢霉素C的產(chǎn)量提高作用二、次級(jí)代謝產(chǎn)物碳源分解調(diào)節(jié)

例如：頂頭孢霉發(fā)酵產(chǎn)頭孢菌C時(shí)利用不同的主碳源速度產(chǎn)率為蔗糖＞半乳糖＞果糖＞麥芽糖＞葡萄糖抗生素受碳源分解調(diào)節(jié)的可能機(jī)制：第一，可能與菌體生長(zhǎng)速率控制抗生素合成有關(guān)。第二，可能與分解代謝產(chǎn)物的堆積濃度有關(guān)。三、次級(jí)代謝產(chǎn)物氮源分解調(diào)節(jié)

含氮底物的酶的合成受快速利用的氮源，尤其使氨的阻遏。機(jī)制：NH4+影響pH值和電化學(xué)的質(zhì)子梯度，改變能量代謝，影響細(xì)胞壁物質(zhì)和膜的結(jié)構(gòu)功能等。（一）次級(jí)代謝自身產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)

抗生素對(duì)自身產(chǎn)物的抑制有一定的規(guī)律：抑制特定產(chǎn)生菌合成抗生素所需濃度與生產(chǎn)水平具相關(guān)性，一般產(chǎn)生菌產(chǎn)量高，對(duì)自身抗生素的耐受力強(qiáng)，反之越敏感。

如青霉素產(chǎn)生菌完全由抑制需要的外源青霉素濃度：高產(chǎn)菌株：15μg/mL

中產(chǎn)菌株：2μg/mL

低產(chǎn)菌株：0.2μg/mL

四、次級(jí)代謝反饋調(diào)節(jié)（二）分支代謝中初級(jí)代謝物的反饋調(diào)節(jié)對(duì)次級(jí)代謝的影響

第一種方式：

次級(jí)途徑和初級(jí)途徑具有共同的分叉中間體，由分叉中間體產(chǎn)生的初級(jí)代謝終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)可能影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成。

第二種方式：

在次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成途徑中，初級(jí)代謝的終產(chǎn)物作為前體合成次生產(chǎn)物。五、磷酸鹽的調(diào)節(jié)

過(guò)量則促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但是抑制抗生素合成；

亞適量：控制在適合菌體生長(zhǎng)的濃度以下。

調(diào)節(jié)機(jī)制：直接作用和間接效應(yīng)。六、細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)胞內(nèi)產(chǎn)物分泌到胞外；胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)。例如：青霉素發(fā)酵中，產(chǎn)生菌細(xì)胞膜輸入硫化物能力的高低是影響青霉素發(fā)酵單位高低的一個(gè)因素。第四節(jié)代謝調(diào)節(jié)控制育種

代謝控制育種：通過(guò)定向選育某種特定的突變型，改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細(xì)胞膜的透性，以達(dá)到大量積累有益產(chǎn)物的目的。一、組成型突變株的選育

代謝控制發(fā)酵：通過(guò)培養(yǎng)條件來(lái)解除反饋調(diào)節(jié)而使生物合成的途徑朝著需要的方向進(jìn)行。

代謝控制育種：通過(guò)定向選育某種特定的突變型，以達(dá)到大量大量積累有益產(chǎn)物的目的。操縱基因或調(diào)節(jié)基因突變引起酶合成誘導(dǎo)機(jī)制失靈，菌株不經(jīng)誘導(dǎo)也能合成酶、或不受終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變型。乳糖操縱子篩選方法及實(shí)例：1、限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)將菌種誘變后移接到低濃度誘導(dǎo)物的衡化器中連續(xù)培養(yǎng)。如：大腸桿菌在恒化器中培養(yǎng)，限量補(bǔ)充乳糖，選育出不需要乳糖就可以大量產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的組成性突變株。2、循環(huán)培養(yǎng)

在含誘導(dǎo)物和不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上交替連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)。例如，先用含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)誘變過(guò)的大腸桿菌，稀然后將此培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含乳糖的培養(yǎng)基中，重復(fù)這個(gè)過(guò)程，最終組成性的突變株就會(huì)占優(yōu)勢(shì)而被選出來(lái)。3、鑒別性培養(yǎng)基的利用

以甘油為唯一碳源，菌落上噴O-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），通過(guò)顯示來(lái)判斷半乳糖苷組成型突變株。4、篩選

用誘導(dǎo)能力低，但能作為良好碳源的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，突變體良好生長(zhǎng)，野生型不能生長(zhǎng)。如利用苯-β-半乳糖苷酶組成型突變株。二、抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育

抗分解調(diào)節(jié)突變就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突變。其實(shí)就是篩選合成酶的產(chǎn)生不受碳、氮、磷的代謝阻遏或抑制的突變株，使抗生素提前到菌體生長(zhǎng)期開(kāi)始合成，從而延長(zhǎng)了產(chǎn)抗期而提高產(chǎn)量。

（一）解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育1、循環(huán)培養(yǎng)法：快速利用和慢速利用的碳源交替培養(yǎng)例如，先用含快速利用（如葡萄糖）的培養(yǎng)基培養(yǎng)誘變過(guò)的大腸桿菌，稀釋后將此培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到慢速利用（如蔗糖）的培養(yǎng)基中，重復(fù)這個(gè)過(guò)程，最終抗分解調(diào)節(jié)的突變株就會(huì)占優(yōu)勢(shì)而被選出來(lái)。2、鑒別性培養(yǎng)基：菌落上噴O-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），顯色篩選半乳糖苷酶解除碳源調(diào)節(jié)的突變株。3、特殊氮源：用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物為惟一氮源配制成培養(yǎng)基。4、葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物

如2-脫氧葡萄糖（2-dG）和3-O-甲基葡萄糖（3-mG），不被微生物利用，不被代謝，但可以阻遏誘導(dǎo)酶的合成。篩選方法：低濃度葡萄糖類似物及一種生長(zhǎng)碳源?？剐酝蛔冎甑男再|(zhì)：抗分解阻遏突變型。（二）解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育（三）解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育1、磷酸鹽對(duì)次生產(chǎn)物的調(diào)節(jié)機(jī)制通過(guò)初級(jí)代謝的變化影響次級(jí)代謝；可以加強(qiáng)初級(jí)代謝，或者改變糖類的分解代謝途徑，或者限制抗生素合成的誘導(dǎo)物。發(fā)酵中，添加濃度要控制在亞適量水平。2、抗磷酸突變株的篩選方法

含氮底物的酶受到快速利用的氮源阻遏，銨鹽和其他快速利用的氮源對(duì)抗生素的生物合成具有分解調(diào)節(jié)作用。2、抗磷酸突變株的篩選方法

Martin建立的一種直觀的篩選磷酸鹽抑制脫敏突變體的方法：三、營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用

缺陷型菌株常常會(huì)使發(fā)生障礙的前一步的中間代謝產(chǎn)物得到累積。（一）在初級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型來(lái)阻斷代謝流向或切斷支路代謝，使代謝朝著有益產(chǎn)物合成方向進(jìn)行。也可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型解除協(xié)同反饋效應(yīng)，降低終產(chǎn)物的數(shù)量，以累積支路代謝中某一末端產(chǎn)物。1、在直線式生物合成途徑中2、在分支式生物合成途徑中（二）在次級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用如：四環(huán)素、制霉素產(chǎn)生菌的脂肪酸缺陷型可增加相應(yīng)抗生素的發(fā)酵單位。四、滲漏缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用

滲漏缺陷型是遺傳代謝障礙不完全的突變株。其特點(diǎn)是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養(yǎng)基上少量生長(zhǎng)。可以利用滲漏缺陷型能少量地合成代謝終產(chǎn)物，又不造成反饋抑制的現(xiàn)象。五、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育

這是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的突變型菌株。

特點(diǎn)：所需產(chǎn)物不斷積累，不會(huì)因其濃度超量而終止生產(chǎn)?？狗答佂蛔冃停唤Y(jié)構(gòu)基因的突變，變構(gòu)酶不能與代謝終產(chǎn)物相結(jié)合。

抗阻遏突變型：調(diào)節(jié)基因的突變，調(diào)節(jié)蛋白不能和代謝終產(chǎn)物結(jié)合。（一）回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株1、原因（1）原有基因的回復(fù)突變基因內(nèi)部位點(diǎn)突變引起的逆向突變現(xiàn)象。

A.真正的回復(fù)突變；B.基因內(nèi)抑制突變。（2）非原有基因的回復(fù)突變?cè)蛔兓蜞徑幕虬l(fā)生突變，抑制了前一個(gè)突變基因的效應(yīng)——抑制基因突變。區(qū)別方法：回交試驗(yàn)和雜交重組?；貜?fù)突變株野生菌株突變型抑制基因回復(fù)突株野生型真正的回復(fù)突變2.回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選（1）初級(jí)代謝途徑障礙性回復(fù)突變型回復(fù)突變?cè)谠蛔凕c(diǎn)以外的位置，反饋調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的調(diào)節(jié)中心發(fā)生突變，它不能再和阻遏物結(jié)合，使有效代謝產(chǎn)物大量積累。如芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶，首先選取低產(chǎn)菌株獲得一部分嘌呤和嘧啶缺陷型，再進(jìn)一步篩選得到回復(fù)突變株，使蛋白酶的產(chǎn)率提高5~10倍。（2）次級(jí)代謝途徑障礙性的回復(fù)突變

零變株的回復(fù)突變：突變可以發(fā)生初級(jí)代謝，也可以發(fā)生在次級(jí)代謝途徑中，發(fā)生回復(fù)突變后，產(chǎn)量往往比原親本株高。途徑：原養(yǎng)型→零突變株→回復(fù)突變株

如一株不產(chǎn)金霉素的綠色鏈霉菌的缺陷型誘發(fā)回復(fù)突變?yōu)樵B(yǎng)型菌株，金霉素的產(chǎn)率比親株提高了6倍。（二）耐自身產(chǎn)物突變株選育

高產(chǎn)菌株必須具備很強(qiáng)的對(duì)自身產(chǎn)物的耐受性，要提高抗生素的發(fā)酵水平，可以選育對(duì)自身抗生素敏感性低，鈍化酶活性高的菌株。選育時(shí)可以結(jié)合以下抗性菌株的篩選：

1.抗鎂離子突變：提高鈍化酶的活性。

2.鈍化酶活性高的變株：（三）抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育

結(jié)構(gòu)類似物起共遏物作用，但不真正摻入細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是“假反饋抑制”。如果能找到適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)類似物，將使抗反饋抑制突變菌株的簡(jiǎn)單容易且效果明顯?？菇Y(jié)構(gòu)類似物突變株，相比于營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變，其代謝調(diào)節(jié)被解除，生產(chǎn)操作方便，產(chǎn)率穩(wěn)定。1.直線合成途徑

如抗刀豆氨酸的突變株，可以有效的積累精氨酸。2.分支途徑如產(chǎn)肌苷酸的枯草桿菌的腺嘌呤缺陷型，選育出抗8-氮鳥(niǎo)嘌呤突變株，肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸的產(chǎn)量明顯提高。篩選方法：濃度梯度法實(shí)例抗蘇氨酸和異亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變型抗代謝類似物的篩選方法（四）累積前體和耐前體突變株的選育

用一系列濃度梯度的平板檢測(cè)前體物對(duì)抗生素合成的產(chǎn)量影響：其一作為組成成分摻入生物合成；其二導(dǎo)致反饋調(diào)節(jié)；其三引起“毒性”。1、耐“毒性”前體突變株的選育2、耐前體結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育3、耐前體的有關(guān)代謝物突變株的篩選1、耐“毒性”前體突變株的選育如：灰黃霉素產(chǎn)生菌耐氯化物前體高產(chǎn)菌株的選育。2、耐前體結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育如：硝吡咯菌素產(chǎn)生菌耐5-氟色氨酸的前體高產(chǎn)菌株的選育。3、耐前體的有關(guān)代謝物突變株的篩選如：抗纈氨酸的的麥迪霉素高產(chǎn)菌株的選