食品微生物檢驗(yàn)方法ISOFDA

食品微生物檢驗(yàn)方法中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限有限責(zé)任公司何艷玲內(nèi)容提要菌落總數(shù)檢測(cè)大腸菌群及大腸桿菌檢測(cè)金黃色葡萄球菌檢測(cè)沙門氏菌檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)菌落總數(shù)測(cè)定——菌落總數(shù)的概念菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)測(cè)定——衛(wèi)生學(xué)意義判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。及時(shí)反映食品加工過程是否符合衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則可考慮致病菌污染的可能性越大，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。

FDABAM菌落總數(shù)測(cè)定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）35℃，48±2h菌落計(jì)數(shù)FDABAM菌落計(jì)數(shù)方法選擇25~250CFU之間的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足25CFU，報(bào)告EAPC/ml（g）為＜25*1/d。EAPC：estimatedaerobicplatecount所有平板的菌落數(shù)都超過250CFU，但不足100/cm2，報(bào)告EAPC/ml（g）為最接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計(jì)值，乘以相應(yīng)的稀釋度。所有平板的菌落數(shù)都超過100/cm2，計(jì)算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計(jì)最高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應(yīng)平板面積作為該稀釋度的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，報(bào)告EAPC/ml（g）為＞65*100*1/d。無法計(jì)數(shù)的平板報(bào)告LA（LaboratoryAccident）。最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進(jìn)偶不進(jìn)。

ISO4833-2003菌落總數(shù)測(cè)定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）每皿內(nèi)加入適量（12~15mL）平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA），30±1℃，72±3h菌落計(jì)數(shù)如果懷疑樣品中含有在培養(yǎng)基表面蔓延生長的菌落，待瓊脂凝固后，在其上覆蓋一層（4mL）水瓊脂。平板疊放不超過6個(gè)ISO4833-2003菌落計(jì)數(shù)方法選擇連續(xù)2個(gè)稀釋度不超過300CFU的平板，且一個(gè)平板至少含15CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：N=∑C/（n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計(jì)算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m固體樣品：NE=m×d-1無菌生長：液體樣品：lessthan1;固體樣品：lessthan1×d-1最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。菌落總數(shù)測(cè)定幾點(diǎn)說明由于檢樣中采用30/35℃有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)，一些特殊營養(yǎng)要求的細(xì)菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來。鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊，也可以來源于單個(gè)細(xì)胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容積或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）報(bào)告。菌落總數(shù)測(cè)定幾點(diǎn)要求每個(gè)樣品從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不得超過15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長時(shí)間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長。檢樣過程中應(yīng)用稀釋劑做空白對(duì)照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時(shí)，檢樣過程中應(yīng)在工作臺(tái)上打開一塊空白平板計(jì)數(shù)瓊脂，其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。檢樣稀釋液有時(shí)帶有食品顆粒，為避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計(jì)數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4℃放置，以便在計(jì)數(shù)檢樣時(shí)用作對(duì)照。大腸菌群的定定義大腸菌菌群系系指一一群能能發(fā)酵酵乳糖糖、產(chǎn)產(chǎn)酸產(chǎn)產(chǎn)氣、、需氧氧和兼兼性厭厭氧的的革蘭蘭氏陰陰性無無芽孢孢桿菌菌。大腸菌菌群不不是細(xì)細(xì)菌學(xué)學(xué)上的的分類類命名名，而而是根根據(jù)衛(wèi)衛(wèi)生學(xué)學(xué)方面面的要要求，，提出出的與與糞便便污染染有關(guān)關(guān)的細(xì)細(xì)菌，，即作作為食食品、、水體體等是是否受受過人人畜糞糞便污污染的的指示示菌，，這些些細(xì)菌菌在生生化及及血清清學(xué)方方面并并非完完全一一致。。根據(jù)據(jù)進(jìn)一一步的的生化化試驗(yàn)驗(yàn)，可可將這這群細(xì)細(xì)菌再再分為為大腸腸艾希希氏菌菌（俗俗稱大大腸桿桿菌））、弗弗氏檸檸檬酸酸桿菌菌、肺肺炎克克雷伯伯氏菌菌和陰陰溝腸腸桿菌菌等。。大腸桿桿菌的的定義義大腸桿桿菌（（也稱稱大腸腸埃希希氏菌菌），，分類類于腸腸桿菌菌科，，歸屬屬于埃埃希氏氏菌屬屬。大腸桿桿菌指指革蘭蘭氏陰陰性無無芽孢孢桿菌菌、乳乳糖發(fā)發(fā)酵產(chǎn)產(chǎn)酸產(chǎn)產(chǎn)氣、、IMViC試試驗(yàn)（（靛基基質(zhì)、、MR、V-P、檸檸檬酸酸鹽試試驗(yàn)））為++--或或-+--的細(xì)細(xì)菌。。與人類類有關(guān)關(guān)的大大腸桿桿菌統(tǒng)統(tǒng)稱為為致瀉瀉性大大腸桿桿菌，，包括括五種種：腸腸毒素素性大大腸桿桿菌（（ETEC）、、致病病性大大腸桿桿菌（（EPEC）、、出血血性大大腸桿桿菌（（EHEC）、、侵襲襲性大大腸桿桿菌（（EIEC）、、黏附附性大大腸桿桿菌（（EAEC）。。大腸菌菌群和和大腸腸桿菌菌的關(guān)關(guān)系耐熱大大腸菌菌群的的定義義：能在液液體乳乳糖培培養(yǎng)基基中35/37℃℃培培養(yǎng)48h產(chǎn)酸酸產(chǎn)氣氣，并并在44.5℃℃培養(yǎng)養(yǎng)24h產(chǎn)產(chǎn)酸產(chǎn)產(chǎn)氣的的細(xì)菌菌（依依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)）衛(wèi)生學(xué)學(xué)意義義大腸菌菌群和和大腸腸桿菌菌是評(píng)評(píng)價(jià)衛(wèi)衛(wèi)生質(zhì)質(zhì)量的的重要要指標(biāo)標(biāo)，作作為食食品中中的糞糞便污污染指指標(biāo)。。食品中中檢出出大腸腸菌群群，表表明該該食品品有糞糞便污污染，，既可可能有有腸道道致病病菌存存在，，因而而也就就有可可能通通過污污染的的食品品引起起腸道道傳染染病的的流行行。大大腸菌菌群數(shù)數(shù)的高高低，，表明明了糞糞便污污染的的程度度，也也反映映了對(duì)對(duì)人體體健康康危害害性的的大小小。大腸桿桿菌在在外界界存活活時(shí)間間與一一些主主要腸腸道致致病菌菌接近近，它它的出出現(xiàn)預(yù)預(yù)示著著某些些腸道道病原原菌的的存在在，因因此該該菌是是國際際上公公認(rèn)的的衛(wèi)生生監(jiān)測(cè)測(cè)指示示菌。。近年年來，，有些些國家家在執(zhí)執(zhí)行HACCP管理理中，，將大大腸桿桿菌檢檢測(cè)作作為微微生物物污染染狀況況的監(jiān)監(jiān)測(cè)指指標(biāo)和和HACCP實(shí)實(shí)施效效果的的評(píng)估估指標(biāo)標(biāo)。大腸桿桿菌的的生物物學(xué)特特性基本形形態(tài)：：此菌為為兩端端鈍圓圓的短短小桿桿菌，，一般般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μμm，，多單單獨(dú)存存在或或成雙雙，但但不呈呈長鏈鏈排列列。約約50%的的菌株株有周周生鞭鞭毛，，但多多數(shù)只只有1-4根，，一般般不超超過10根根，故故菌體體動(dòng)力力弱。。多數(shù)數(shù)菌株株有菌菌毛，，有的的有莢莢膜或或微莢莢膜，，不形形成芽芽孢，，對(duì)普普通堿堿性染染料著著色良良好，，革蘭蘭氏染染色陰陰性。。大腸桿桿菌的的生物物學(xué)特特性培養(yǎng)特特性：：大腸桿桿菌合合成代代謝能能力強(qiáng)強(qiáng)，在在含無無機(jī)鹽鹽、銨銨鹽、、葡萄萄糖的的普通通培養(yǎng)養(yǎng)基上上生長長良好好。最最適生生長溫溫度為為37℃，，在42-44℃℃條件件下仍仍能生生長，，生長長溫度度范圍圍15-46℃℃。。在普通通營養(yǎng)養(yǎng)瓊脂脂上有有3中中菌落落形態(tài)態(tài)：1）光光滑型型：菌菌落邊邊緣整整齊，，表面面有光光澤、、濕潤潤、光滑、、呈灰灰色，，在生生理鹽鹽水中中易分分散；；2）粗粗糙型型：菌菌落扁扁平、、干澀澀、邊邊緣不不整齊齊，易易在生理理鹽水水中自自凝；；3）黏液液型：常常為含有有莢膜的的菌株。。大腸菌群群及大腸腸桿菌測(cè)測(cè)定———MPN法法檢驗(yàn)流流程（FDABAM）檢樣50g+450ml稀釋釋液適當(dāng)十倍倍稀釋樣樣品選擇3個(gè)個(gè)適宜的的連續(xù)稀稀釋度的的樣品稀稀釋液，，每個(gè)稀釋釋度接種種三管LST肉肉湯（每每管9mlLST肉湯湯并加有有導(dǎo)管）），每管接種種1mL35℃，，24±2h~48±2h沒有產(chǎn)氣氣管有有產(chǎn)產(chǎn)氣管報(bào)告陰性性接種BGLB肉肉湯管接接種EC肉湯湯35±±℃，，48±2h44.5±0.5℃℃（（水浴培培養(yǎng)）24±±2h~48±±2h查MPN表報(bào)告告結(jié)果產(chǎn)氣管接接種EMB平板板（35℃、18~24h））（大腸菌菌群）從EMB平板上上挑取5個(gè)可疑疑菌轉(zhuǎn)接接到PCA斜面，進(jìn)行行革蘭氏氏染色、、IMVC生化化鑒定、、接種LST復(fù)檢產(chǎn)產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告告結(jié)果（大腸桿桿菌）大腸菌群群測(cè)定———MPN法法檢驗(yàn)幾幾點(diǎn)說明明MPN檢檢索表：：MPN為為最大大可能數(shù)數(shù)(MostProbableNumber)的簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱。這這種方法法，對(duì)樣樣品進(jìn)行行連續(xù)系系列稀釋釋，加入入培養(yǎng)基基進(jìn)行培培養(yǎng)，從從規(guī)定的的反應(yīng)呈呈陽性管管數(shù)的出出現(xiàn)率，，用概率率論來推推算樣品品中菌數(shù)數(shù)最近似似的數(shù)值值。MPN檢檢索表只只給了三三個(gè)稀釋釋度，如如改用不不同的稀稀釋度，，則表內(nèi)內(nèi)數(shù)字應(yīng)應(yīng)相應(yīng)降降低或增增加10倍。初發(fā)酵和和證實(shí)試試驗(yàn)：1）兩步步法進(jìn)行行了兩次次乳糖發(fā)發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)。初發(fā)發(fā)酵和證證實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)所用培培養(yǎng)基不不同，但但都是為為了證實(shí)實(shí)培養(yǎng)物物是否符符合大腸腸菌群的的定義，，即“在在37℃℃分解乳乳糖產(chǎn)酸酸產(chǎn)氣””。LST中中提供了了磷酸鹽鹽緩沖體體系，氯氯化鈉可可維持滲滲透壓，，月桂基基硫酸鈉鈉可抑制制非大腸腸菌群的的生長，，這個(gè)緩緩沖蛋白白胨乳糖糖肉湯允允許“緩緩慢乳糖糖發(fā)酵（（Slowlactosefermentations））”來促促進(jìn)菌體體產(chǎn)氣。。BGLB中膽膽鹽和煌煌綠可以以抑制革革蘭氏陽陽性細(xì)菌菌和除了了大腸菌菌群的很很多革蘭蘭氏陰性性細(xì)菌。。2）初發(fā)酵陽陽性管，，不能肯肯定就是是大腸菌菌群細(xì)菌菌，經(jīng)過過證實(shí)試試驗(yàn)后，，有時(shí)可可能成為為陰性。。有數(shù)據(jù)表表明，食食品中大大腸菌群群檢驗(yàn)步步驟的符符合率，，初發(fā)酵酵與證實(shí)實(shí)試驗(yàn)相相差較大大。因此此，在實(shí)實(shí)際檢測(cè)測(cè)工作中中，證實(shí)實(shí)試驗(yàn)是是必需的的。產(chǎn)氣量與與倒管：：在乳糖發(fā)發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)工作中中，經(jīng)常?？梢钥纯吹皆诎l(fā)發(fā)酵倒管管內(nèi)極微微少的氣氣泡（有有時(shí)比小小米粒還還小），，有時(shí)可可以遇到到在初發(fā)發(fā)酵時(shí)產(chǎn)產(chǎn)酸或沿沿管壁有有緩緩上上浮的小小氣泡。。實(shí)驗(yàn)表表明，大大腸菌群群的產(chǎn)氣氣量，多多者可以以使發(fā)酵酵倒管全全部充滿滿氣體，，少者可可以產(chǎn)生生比小米米粒還小小的氣泡泡。如果果對(duì)產(chǎn)酸酸但未產(chǎn)產(chǎn)氣的乳乳糖發(fā)酵酵如有疑疑問時(shí)，，可以用用手輕輕輕打動(dòng)試試管，如如有氣泡泡沿管壁壁上浮，，即應(yīng)考考慮可能能有氣體體產(chǎn)生，，而應(yīng)作作進(jìn)一步步試驗(yàn)。。不適于用用大腸菌菌群作為為糞便污污染指示示菌的食食品冷凍食品品經(jīng)射線照照射處理理的食品品pH較高高的食品品在上述食食品中大大腸菌群群的細(xì)菌菌比許多多腸道病病原微生生物更易易死亡。。大腸桿菌菌測(cè)定———EMB選選擇性分分離鑒別別EMB平平板典型型大腸桿桿菌菌落特特征：中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤澤大腸桿菌菌測(cè)定———EMB選選擇性分分離鑒別別EMB是是一種弱弱選擇性性培養(yǎng)基基，一些些球菌也也可在該該培養(yǎng)基基上生長長；高壓滅菌菌可使得得美藍(lán)還還原從而而使培養(yǎng)養(yǎng)基的顏顏色呈不不均一橘橘黃色，，輕輕搖搖動(dòng)培養(yǎng)養(yǎng)基可以以恢復(fù)原原有的正正常紫色色，傾注注平板前前應(yīng)先搖搖勻；大腸桿菌菌在該培培養(yǎng)基上上并不一一定總是是呈現(xiàn)綠綠色的金金屬光澤澤；該培養(yǎng)基基受可見見光易使使其中的的成分氧氧化，儲(chǔ)儲(chǔ)存及培培養(yǎng)細(xì)菌菌時(shí)都應(yīng)應(yīng)在避光光條件。。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無色鼠傷寒沙門氏菌無色糞鏈球菌無色大腸桿菌菌測(cè)定——革蘭蘭氏染色色基本原理理：革蘭氏染染色法是是細(xì)菌學(xué)學(xué)中廣泛泛使用的的一種重重要的鑒鑒別染色色法。1884年由丹丹麥醫(yī)師師Gram創(chuàng)立立。此法法可將細(xì)細(xì)菌分為為革蘭氏氏陰性菌菌和革蘭蘭氏陽性性菌兩大大類。革蘭氏染染色的機(jī)機(jī)理主要要是利用用兩類細(xì)細(xì)菌的細(xì)細(xì)胞壁成成分和結(jié)結(jié)構(gòu)的不不同。革蘭氏陰陰性菌的細(xì)胞胞壁中含含有較多多的類脂脂質(zhì)，而而肽聚糖糖的含量量較少。。當(dāng)用酒酒精或丙丙酮酸脫脫色時(shí)，，類脂質(zhì)質(zhì)被溶解解，增加加了細(xì)胞胞壁的通通透性，，使初染染后的結(jié)結(jié)晶紫和和碘的復(fù)復(fù)合物易易于滲出出，結(jié)果果細(xì)胞被被脫色，，經(jīng)復(fù)染染后，又又染上復(fù)復(fù)染液的的顏色。。而革蘭氏陽陽性菌細(xì)胞壁壁中肽聚聚糖的含含量多而而且交聯(lián)聯(lián)度大，，類脂質(zhì)質(zhì)含量少少，經(jīng)乙乙醇或丙丙酮洗脫脫后，肽肽聚糖層層的孔徑徑變小，，通透性性降低，，因此細(xì)細(xì)胞仍保保留初染染時(shí)的顏顏色。大腸桿菌菌測(cè)定——革蘭蘭氏染色色GramnegativeGrampositiveGramstraining大腸桿菌菌測(cè)定——革蘭蘭氏染色色基本步驟驟：將涂片在在火焰上上固定，，滴加結(jié)結(jié)晶紫染染液，染染1min，水水洗；滴加革蘭蘭氏碘液液，作用用1min，水水洗；滴加95%乙醇醇脫色約約15～～30s,直至至染色液液被洗掉掉，不要要過分脫脫色，水水洗；滴加番紅紅復(fù)染液液，復(fù)染染1min，水水洗、待待干、鏡鏡檢。結(jié)果：革革蘭氏陽陽性菌呈呈紫色，革蘭氏氏陰性菌菌呈紅色。大腸桿菌菌測(cè)定——生化化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-Kovacs’MR紅色不變色++甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色--V-P甲、乙液Citrate生長不生長---IMViC生化化試驗(yàn)金黃色葡葡萄球菌菌——生生物學(xué)特特性金黃色葡葡萄球菌菌呈球形形，直徑0.8μm左左右，排排列成葡葡萄串狀，，無芽孢孢，無莢莢膜。革蘭氏染染色陽性性，但衰衰老、死亡或被被白細(xì)胞胞吞噬的的菌體，，常呈革蘭蘭氏陰性性。金黃色葡葡萄球菌菌——生生長特性性金黃色葡葡萄球菌菌在肉湯湯中呈渾渾濁生長長，在胰胰酪胨大大豆肉湯湯內(nèi)有時(shí)時(shí)液體澄澄清，菌菌量多時(shí)時(shí)呈渾濁濁生長。。血平板上上金黃色色葡萄球球菌呈金金黃色，，有時(shí)也也為白色色，大而而突起、、圓形、、不透明明、表面面光滑，，周圍有有溶血圈圈。Baird-Parker平平板上金金黃色葡葡萄球菌菌圓形突突起、光光滑、濕濕潤，顏顏色呈灰灰色到黑黑色，邊邊緣淡色色，周圍圍為一渾渾濁帶，，在其外外層有一一透明圈圈。用接接種針接接觸菌落落似有奶奶油樹膠膠的硬度度。金黃色葡葡萄球菌菌檢驗(yàn)———方法法適用性性MPN法法：適用用于檢測(cè)測(cè)帶有大大量競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)菌的食食品及其其原料和和未經(jīng)處處理的含含少量金金黃色葡葡萄球菌菌的食品品。直接平板計(jì)計(jì)數(shù)法：適適用于檢查查金黃色葡葡萄球菌數(shù)數(shù)不小于10/g（（ml）的的食品。增菌培養(yǎng)法法：適用于于檢查含有有受損傷的的金黃色葡葡萄球菌的的加工食品品。定量方法定性方法金黃色葡萄萄球菌檢驗(yàn)驗(yàn)——直接平平板計(jì)數(shù)法法檢樣（50g+450mL稀稀釋液）適當(dāng)十倍稀稀釋樣品選擇2~3個(gè)連續(xù)適適宜稀釋度度吸取1ml菌液按照照0.3mL、0.3mL、、0.4mL分別涂涂布于3塊90mmBaird-Parker平板上上（做平行試試驗(yàn)）35℃，，45~48h確證試驗(yàn)報(bào)告或涂布于1塊140mm平板板上FDABAM金金黃色葡萄萄球菌檢驗(yàn)驗(yàn)——MPN法檢樣（50g+450mL稀稀釋液）適當(dāng)十倍稀稀釋樣品選擇3個(gè)適適宜的連續(xù)續(xù)稀釋度的的樣品稀釋釋液，每個(gè)稀釋度度接種三管管10%NaClTSB肉肉湯，每管接種1mL35℃，，48±±2h從生長的管管中接種1環(huán)劃線于于Baird-Parker平板上上35℃，，48h確證試驗(yàn)報(bào)告含1%丙酮酮酸鈉FDABAM金金黃色葡萄萄球菌確證證試驗(yàn)1.凝固酶酶試驗(yàn)方法：從平板上至至少挑取1個(gè)可疑金金黃色葡萄萄球菌菌落落，移種到到TSB/BHI肉肉湯中，置置35℃培培養(yǎng)18-24h。。取肉湯培培養(yǎng)物0.3mL同同0.5mL凝固酶酶試驗(yàn)兔血血漿充分混混合，置35℃培養(yǎng)養(yǎng)，定時(shí)觀觀察是否有有凝塊形成成，至少觀觀察6h。。試驗(yàn)中需同同時(shí)做已知知陽性和陰陰性對(duì)照。。結(jié)果判定：：以內(nèi)容物完完全凝固，，使試管倒倒置或傾斜斜時(shí)不流動(dòng)動(dòng)為陽性。。部分凝固固（2+和和3+）的的必須進(jìn)行行生化鑒定加以證實(shí)。。FDABAM金黃黃色葡萄球球菌確證試試驗(yàn)2.革蘭氏氏染色對(duì)所有的可可疑培養(yǎng)物物都要進(jìn)行行革蘭氏染染色。3.生化鑒鑒定過氧化氫酶酶試驗(yàn)葡萄糖厭氧氧利用試驗(yàn)驗(yàn)甘露醇厭氧氧利用試驗(yàn)驗(yàn)金葡溶菌酶酶敏感性試試驗(yàn)?zāi)蜔岷怂崦该冈囼?yàn)（輔輔助）StaphylococcusaureusonDNaseAgarFDABAM2種葡萄球球菌和微球球菌的典型型特性特性S.aureusS.epidermidisMicrococci過氧化氫酶+++凝固酶+--耐熱核酸酶+--溶菌酶++-厭氧利用葡萄糖++-甘露醇+--ISO金金黃色葡萄萄球菌檢驗(yàn)驗(yàn)——MPN法檢樣（xg+9xmL稀釋液液）適當(dāng)十倍稀稀釋樣品選擇3個(gè)適適宜的連續(xù)續(xù)稀釋度的的樣品稀釋釋液，每個(gè)稀釋度度接種三管管modifiedGiolittiandCantonibroth，37℃，，24~48h從變黑或出出現(xiàn)黑色沉沉淀的管中中接種1環(huán)培培養(yǎng)物于Baird-Parker平板上37℃，，48h確證試驗(yàn)報(bào)告接種10mL于10mL雙雙料肉湯，，接種1mL于9mL單料料肉湯。小心的于接接種管中培培養(yǎng)基頂部部?jī)A注一定定量的水瓊瓊脂，使其其凝固形成成密封塞。。ISO金金黃色葡萄萄球菌確證證試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)驗(yàn)結(jié)果判定：：-1+2+3+4+negativepositive沙門氏菌屬屬簡(jiǎn)介1880年E.Berth首先發(fā)現(xiàn)傷傷寒沙門氏氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬豬霍亂沙門門氏菌，以以后取Salmon氏之名為本本菌屬之名名。沙門氏菌屬屬是一群符符合腸桿菌菌科定義并并與其血清清學(xué)相關(guān)的的革蘭氏陰陰性、需氧氧性、無芽芽孢桿菌。。本菌屬種種類繁多，，抗原結(jié)構(gòu)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多多個(gè)血清型，，我國已發(fā)發(fā)現(xiàn)血清型型近200個(gè)。沙門氏菌屬屬——生物學(xué)特性性形態(tài)特征：：革蘭氏陰性性，大小為為1~3××0.4~0.9μμm的兩端端鈍圓的短短桿菌，無無芽孢，一一般無莢膜膜，除雞沙沙門氏菌和和雛沙門氏氏菌以外，，都有周身身鞭毛，運(yùn)運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。。培養(yǎng)特性：：沙門氏菌需需氧或兼性性厭氧，10-42℃都可可生長，最最適生長溫溫度為37℃，最適適pH為6.8~7.8。營養(yǎng)瓊脂平平板上：35~37℃培養(yǎng)18~24h，其菌菌落大小一一般為2~3mm，，光滑、濕濕潤、無色色、半透明明、邊緣整整齊。血平板上：：中等大小小的灰白色色菌落。生化特性：：絕大多數(shù)沙沙門氏菌有有規(guī)律的發(fā)發(fā)酵葡萄糖糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣氣，但也有有不產(chǎn)氣者者，不發(fā)酵酵蔗糖和側(cè)側(cè)金盞花醇醇、不產(chǎn)生生吲哚、不不分解尿素素。沙門氏菌屬屬——生物學(xué)特性性沙門氏菌屬屬的抗原菌體抗原（（O抗原））表面抗原（（K抗原））：Vi抗抗原和M抗抗原鞭毛抗原（（H抗原））纖毛抗原FDABAM沙門門氏菌檢驗(yàn)驗(yàn)流程前增菌25g樣+225mL乳糖肉肉湯（肉制品、、肉副產(chǎn)品品、動(dòng)物產(chǎn)產(chǎn)品）勻質(zhì)2min，室溫溫放置60±5min混合均勻，，測(cè)定調(diào)節(jié)節(jié)PH6.8±0.235℃、24±2h選擇性增菌菌0.1ml+10mlMM（（RV）1ml+10mlTTB42℃、24h（水浴培養(yǎng)養(yǎng)）35℃、24h43℃℃、24h（水浴培養(yǎng)養(yǎng)）含菌量高含含菌量低低分離培養(yǎng)劃線接種選選擇性培培養(yǎng)基（BS、XLD、HE）35℃、24~48h（BS）生化鑒定每個(gè)平板挑挑取至少2個(gè)可疑菌菌（包括典典型和非典典型各2個(gè)個(gè)）接種TSI三糖鐵、、LIA賴賴氨酸鐵高高層斜面（LIA高高層深4cm）（松蓋以保保持有氧條條件防止產(chǎn)產(chǎn)生過多H2S）35℃、24±2h棄去尿尿素酶酶試驗(yàn)衛(wèi)衛(wèi)矛醇、氰氰化鉀鉀、丙二酸酸鈉、吲哚哚試驗(yàn)陽性陰性血清學(xué)血清學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)——沙門氏氏菌的分類類報(bào)告結(jié)果生鮮食物、、嚴(yán)重污染染的食品和和動(dòng)物飼料料ISO6579沙門門氏菌檢驗(yàn)驗(yàn)流程前增菌25g樣+225mLBPW勻質(zhì)37±1℃℃、18±±2h選擇性增菌菌0.1ml+10mlRVS1ml+10mlMKTTn41.5±±1℃℃、24±±3h37±±1℃℃、24±±3h（水浴培養(yǎng)養(yǎng)）分離培養(yǎng)劃線接種選選擇性培養(yǎng)養(yǎng)基（XLD和第二二種選擇性性培養(yǎng)基，，如BS）37℃、24~48h（BS）每個(gè)平板挑挑取至少5個(gè)可疑菌菌進(jìn)行純培養(yǎng)和確認(rèn)試驗(yàn)驗(yàn)37℃、24±3h生化鑒定TSI、尿尿素酶、賴賴氨酸脫羧羧酶、β-牛乳糖、、V-P、、吲哚試試驗(yàn)血清學(xué)血清學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)——沙門氏氏菌的分類類報(bào)告結(jié)果ISO6579沙門門氏菌生化化試驗(yàn)表試驗(yàn)沙門氏菌屬傷寒A型副傷寒B型副傷寒C型副傷寒其他菌屬反應(yīng)%b反應(yīng)%b反應(yīng)%c反應(yīng)%c反應(yīng)%bTSI葡萄糖產(chǎn)酸+100+100+++100TSI葡萄糖產(chǎn)氣-d0+100+++92TSI乳糖產(chǎn)酸-2-100---1TSI蔗糖產(chǎn)酸-0-0---1TSI硫化氫產(chǎn)生+97-10+++92尿素水解-0-0---1賴氨酸脫羧酶+98-0+++95β-牛乳糖反應(yīng)-0-0---2eV-P反應(yīng)-0-0---0吲哚反應(yīng)-0-0---1b：百分率表明并不是所有分離到的沙門氏菌血清型都會(huì)顯示+或-的結(jié)果。c：這些百分率不能從現(xiàn)有的文獻(xiàn)中獲得。d：傷寒沙門氏菌不產(chǎn)氣e：亞利桑那亞型腸炎沙門氏菌為乳糖陽性或陰性反應(yīng)，但通常β-牛乳糖反應(yīng)陽性。沙門氏菌檢檢驗(yàn)選擇性性分離培養(yǎng)養(yǎng)XLD瓊脂脂：FDABAM———典型菌落落：粉色菌菌落，帶或或不帶黑色色中心。許許多沙門氏氏菌培養(yǎng)物物可呈現(xiàn)大的具光光澤的黑色色中心或幾幾乎為全部部黑色的菌菌落。——非典型型菌落：黃黃色帶或不不帶黑色中中心。ISO———中心黑色色、周圍由由于指示劑劑顏色的改改變而出現(xiàn)現(xiàn)紅色的輕輕微透明帶帶。菌名菌落形態(tài)鼠傷寒沙門氏菌紅色，有黑心傷寒沙門氏菌紅色，有黑心弗氏志賀氏菌紅色大腸埃希氏菌黃色，有膽鹽沉淀環(huán)糞鏈球菌-沙門氏菌檢檢驗(yàn)選擇性性分離培養(yǎng)養(yǎng)BS瓊脂：：FDABAM———典型菌落落：產(chǎn)硫化化氫菌落黑黑色有金屬屬光澤、棕棕褐色或灰灰色，菌落落周圍的培養(yǎng)基基通常開始始呈褐色，，但伴隨培培養(yǎng)時(shí)間的的延長而變?yōu)楹谏?，并有暈環(huán)環(huán)效應(yīng)；——非典型型菌落：有有些菌株不不產(chǎn)生硫化化氫，形成成灰綠色菌菌落，周圍圍培養(yǎng)基不變色。。菌名菌落形態(tài)傷寒沙門氏菌黑色，有金屬光澤鼠傷寒沙門氏菌黑色，有金屬光澤奇異變形桿菌褐色或呈黑色，無金屬光澤弗氏志賀氏菌棕色至綠