DNA多態(tài)性及其分析技術(shù)教學(xué)

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA多態(tài)性及其分析技術(shù)PPT教學(xué)課件第一節(jié)多態(tài)性概述一.定義不同種的生物以及同一種生物的不同個(gè)體之間都存在著許多差異，稱為生物的多態(tài)現(xiàn)象，即生物的多態(tài)性（polymorphism）。生物群體中個(gè)體間的變異有的是由環(huán)境因素，如營養(yǎng)、氣候等造成的；有的則是由遺傳因素造成的。由遺傳因素造成的變異形成一系列的多態(tài)性，稱為遺傳多態(tài)性（genetic

polymorphism

）。第1頁/共28頁二.標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生遺傳分離的基因座位（locus）具有兩個(gè)以上等位基因時(shí)，其最常見的等位基因的頻率不超過0.95或0.99時(shí)，這個(gè)基因座位就被認(rèn)為具有多態(tài)性。在某些時(shí)候，一個(gè)基因位點(diǎn)上只由一個(gè)基因占據(jù)，但有時(shí)這個(gè)位置上缺乏這一基因，這時(shí)就會(huì)出現(xiàn)“有”和“無”兩種情況，被稱為二態(tài)性（dimorphism）。三.分類遺傳多態(tài)性主要可分為遺傳表型的多態(tài)性和DNA的多態(tài)性兩大類。第2頁/共28頁由遺傳控制表現(xiàn)出來的性狀就是遺傳表型。檢測(cè)遺傳表型多態(tài)性有其局限性：①遺傳表型的多態(tài)性只反映出編碼基因的部分變異。后者只占人基因組總DNA的10%（＜10%）?；蚣盎蛳嚓P(guān)序列占總DNA的25%。②DNA序列中的同義突變不會(huì)引起表型的改變。這時(shí)檢測(cè)表型就不能發(fā)現(xiàn)編碼基因中存在的變異。③基因的表達(dá)會(huì)有變異，基因型完全相同的生物體在不同的生長條件下可能有不同的表型，靠檢測(cè)表型多態(tài)性來推斷基因有時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)論。分析DNA的多態(tài)性才能真正深刻地揭示生物的多態(tài)性。第3頁/共28頁人類基因組序列概況人類基因組30億堿基對(duì)非基因序列70%～80%基因及相關(guān)序列20%～30%編碼序列＜10%中度或高度重復(fù)序列20%～30%單一數(shù)或低拷貝序列70%～80%簇狀重復(fù)60%第4頁/共28頁第二節(jié)DNA多態(tài)性的分類DNA是遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ)，因而是反映個(gè)體間差異的最本質(zhì)東西。DNA序列組成的個(gè)體特異性主要表現(xiàn)為下列類型的DNA多態(tài)性。一.基因多態(tài)性由于控制性狀的基因堿基組成上的不同造成的多態(tài)性。采用等位基因特異性探針（ASO或SSO探針）或限制酶切消化進(jìn)行分析。如人類白細(xì)胞抗原（HLA）系統(tǒng)，編碼HLA-DR抗原的位點(diǎn)有超過200個(gè)等位基因。第5頁/共28頁二.重復(fù)序列多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（variablenumbersoftandomrepeats,VNTR）：①相同的核心序列，不同的個(gè)體重復(fù)的次數(shù)不同。②不同的重復(fù)序列，其核心序列的組成會(huì)不同。③在核心序列之間，不同的個(gè)體間會(huì)存在有無插入小段DNA或插入的片段長短不同的差異。因此，兩個(gè)無關(guān)個(gè)體的VNTR的變異能達(dá)到完全個(gè)體特異的程度，這是DNA指紋形成的基礎(chǔ)。中度重復(fù)的散在重復(fù)序列多態(tài)性。遍布哺乳動(dòng)物基因組中第6頁/共28頁三.性染色體多態(tài)性X染色體的重復(fù)序列多態(tài)性Y染色體的特異性片段多態(tài)性。四.線粒體的DNA多態(tài)性人線粒體DNA的D環(huán)兩個(gè)無關(guān)個(gè)體間，完全相同的可能性只有0.27%。第7頁/共28頁第三節(jié)DNA多態(tài)性分析技術(shù)一.RFLP分析技術(shù)基本原理限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）：用某種特定的限制性內(nèi)切酶消化不同的DNA片段，由于DNA的堿基組成不同，就會(huì)產(chǎn)生不同長度的酶切片段。這樣采用合適的限制性內(nèi)切酶消化待分析的DNA片段，就能根據(jù)切出來的片段是否長度一致來推測(cè)其DNA序列是否相同，然后用標(biāo)記好的相應(yīng)的DNA探針與這些片段進(jìn)行雜交，顯出的圖譜就可以反映出基因組DNA堿基序列組成是否存在差異。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是通過核酸的限制性酶切片段長度多態(tài)性來揭示DNA堿基序列組成的不同。第8頁/共28頁抽提DNA（從血或組織）培養(yǎng)細(xì)菌人工合成探針限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠Southern轉(zhuǎn)移、固定質(zhì)粒純化純化探針標(biāo)記探針（同位素或非同位素）預(yù)雜交雜交洗膜反射自顯影或顯色后分析結(jié)果RFLP技術(shù)圖解第9頁/共28頁RFLP技術(shù)的基本步驟一.靶DNA的準(zhǔn)備先將人基因組DNA抽提出來，選用合適的限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA，將酶解出來的具有各種長度的DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離，使其按片段的長短排列，將DNA片段變性后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上（稱為印跡轉(zhuǎn)移，即Southernblot），并固定在這些載體上面。二.核酸探針的標(biāo)記將準(zhǔn)備作為探針的DNA片段純化，用同位素（如32P）或非同位素標(biāo)記，經(jīng)純化后使用。三.雜交顯示將標(biāo)記好的探針與硝酸纖維膜或尼龍膜上的單鏈DNA雜交，洗膜以后進(jìn)行放射自顯影或加入酶的反應(yīng)底物顯色，再對(duì)顯示出來的譜帶進(jìn)行分析。第10頁/共28頁影響RFLP的幾個(gè)因素一.限制性內(nèi)切酶影響RFLP圖譜的重要因素。市售常見的有100多種。星號(hào)*活性即非特異性酶解活性。反應(yīng)液中甘油、乙醇濃度及被酶解DNA的質(zhì)量和濃度。二.核酸探針不同的DNA探針會(huì)顯示出不同類型的RFLP圖譜。1.基因探針人基因組中某一基因的一個(gè)片段。常用于研究人類遺傳性疾病。第11頁/共28頁影響RFLP的幾個(gè)因素2.隨機(jī)探針從人基因組DNA中隨意挑選出一個(gè)DNA片段，其功能并不知道。采用統(tǒng)一的命名法：D后為來源之染色體的號(hào)碼，S為單拷貝（NF代表有多個(gè)片段），最后是分配給定的序號(hào)。如D14S1等。可進(jìn)行疾病基因連鎖分析。3.重復(fù)序列探針基因組中的重復(fù)序列，可同時(shí)揭示整個(gè)基因組中許許多多位點(diǎn)的DNA序列的多態(tài)性。第12頁/共28頁如1985年，Jeffreys等發(fā)現(xiàn)的高度重復(fù)的小衛(wèi)星DNA探針，可揭示人類的DNA序列的多態(tài)性，并且在無關(guān)個(gè)體之間這類多態(tài)性相同的機(jī)會(huì)極微（只有3×10－11），稱為DNA指紋?？捎糜趥€(gè)人識(shí)別和親子鑒定，人類學(xué)的研究。4.人工合成的寡核苷酸探針探測(cè)人基因組中的散在重復(fù)序列，也可用于個(gè)體特異性研究。5.動(dòng)物基因組的一段DNA片段用于研究昆蟲等動(dòng)物，可用此作為探針進(jìn)行相關(guān)研究，進(jìn)行種、群分類。第13頁/共28頁注意事項(xiàng)1.首先檢測(cè)對(duì)象的DNA分子必須保持大分子。在抽提DNA過程中避免人為地將DNA分子機(jī)械性切割成小片段的DNA，否則最終的結(jié)果可能是一種假象。2.在用限制性內(nèi)切酶消化大分子DNA時(shí)，要使DNA被完全消化，否則也會(huì)出假結(jié)果。3.被消化的DNA濃度不能太高。4.電泳時(shí)要低壓電泳。5.雜交前探針必須充分變性。6.要根據(jù)探針標(biāo)記的情況以及探針與靶DNA間序列互補(bǔ)的程度和GC含量來掌握洗膜的條件。7.作放射自顯影時(shí)，要根據(jù)探針標(biāo)記的放射比活性以及靶DNA的量等因素決定曝光的時(shí)間。第14頁/共28頁Jeffreys等從人的染色體DNA中分離出一種重復(fù)序列作為探針，對(duì)人的染色體DNA進(jìn)行RFLP分析（稱為DNA指紋圖）。他們將總DNA用限制性內(nèi)切酶完全酶解以后，用放射性的探針進(jìn)行Southern印跡，每個(gè)人的DNA所產(chǎn)生的陽性雜交條帶都是特異性的，而且子女的陽性雜交帶中，有一半與父親的DNA陽性雜交帶相同，另一半是與母親的陽性雜交帶相同。用這種重復(fù)序列作為探針，對(duì)不同的人的DNA進(jìn)行指紋分析，產(chǎn)生完全相同的圖譜的機(jī)會(huì)小于60億分之一?？捎糜诜ㄡt(yī)鑒定、血緣關(guān)系的識(shí)別等。這一實(shí)驗(yàn)方法所提供的證據(jù)已于1988年得到英國法庭的認(rèn)可。第15頁/共28頁人的DNA指紋分析示意圖子女DNA指紋圖中分別與其父、母的DNA指紋中相應(yīng)的分子雜交條帶相對(duì)應(yīng)父子女母第16頁/共28頁二.PCR分析DNA多態(tài)性基本原理PCR分析DNA多態(tài)性的應(yīng)用1.分析基因多態(tài)性反向點(diǎn)印跡雜交技術(shù)：將等位基因特異性探針（ASO探針）加poly(dT)尾巴，打點(diǎn)固定在硝酸纖維素膜上。將擴(kuò)增產(chǎn)物與之雜交，顯色反應(yīng)后判讀。2.分析擴(kuò)增DNA的RFLP（Am-RFLP）DNA擴(kuò)增（長）限制性酶切瓊脂糖電泳分析3.分析擴(kuò)增片段長度的多態(tài)性DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳分離分析第17頁/共28頁4.分析擴(kuò)增DNA片段序列的多態(tài)性對(duì)DNA擴(kuò)增后進(jìn)行序列分析。不對(duì)稱PCRssDNA

測(cè)序分析比較第18頁/共28頁5.隨機(jī)引物PCR法分析DNA的多態(tài)性RAPD是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA)的英文縮寫。該法最初是由Williams等發(fā)明，其方法是用隨機(jī)序列的9～10個(gè)核苷酸的引物，對(duì)基因組的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行電泳分離。采用任意順序的引物擴(kuò)增基因組DNA，可以在完全不知道特定DNA順序的情況下分析其多態(tài)性，不僅可用于個(gè)人識(shí)別，還可用于其它各種遺傳學(xué)研究。第19頁/共28頁有人建議把通過隨意引物擴(kuò)增的DNA順序，稱為RAPD標(biāo)記，用于比較兩種不同的生物的基因有否區(qū)別。由于所有的RAPD都是顯性的，所以無法區(qū)別擴(kuò)增的DNA片段是來自雜合子還是純合子。目前已有明顯的跡象顯示，RAPD標(biāo)記具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。不但可用于基因制圖，動(dòng)植物培育，DNA指紋分析，而且在染色體特異DNA片段的分離鑒定、雜交細(xì)胞系或遺傳原種中大段染色體的缺失或重復(fù)的篩查等諸方面也將發(fā)揮出重要作用。第20頁/共28頁其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①可以用一系列的通用引物分析不同種類的生物。②可用于制備探針和分析未知的DNA順序。③由于每一個(gè)RAPD標(biāo)記對(duì)應(yīng)一種DNA順序，可大大簡(jiǎn)化多種相關(guān)研究。④RAPD技術(shù)有可能使基因型的鑒別自動(dòng)化，高效基因制圖等工作比應(yīng)用RFLP和普遍PCR技術(shù)更有效，更簡(jiǎn)便。而且人工合成的隨機(jī)引物可在實(shí)驗(yàn)空間進(jìn)行交換，這比克隆DNA片段作為探針要容易和迅速得多，還免去了DNA分子雜交的麻煩。第21頁/共28頁第四節(jié)DNA多態(tài)性分析技術(shù)的應(yīng)用1．研究人類遺傳性疾病人類某些遺傳性疾病是因某一基因的堿基序列中發(fā)生突變，使之缺失了某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，因而使用此限制性內(nèi)切酶無法切出與正常人相同大小的限制性片段來；另一些疾病則表現(xiàn)出相反的情況，出現(xiàn)了原來沒有的某個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。有時(shí)是因插入了某一個(gè)片段引起疾病。用PCR技術(shù)分析DNA多態(tài)性還可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷，對(duì)那些在嬰兒期或少年期發(fā)病的嚴(yán)重影響病人勞動(dòng)生活能力的遺傳性疾病在胚胎期作出確診，采取措施終止妊娠，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育顯得尤為重要。2．建立人類基因組的遺傳連鎖圖以及對(duì)某些有遺傳傾向的疾病作相關(guān)性分析第22頁/共28頁3．作為遺傳標(biāo)記用于單卵雙生或雙卵雙生的診斷，親子鑒定、法醫(yī)個(gè)人識(shí)別以及人類學(xué)的研究等。4．直接作基因分型，特別是作HLA的基因分型，可用于器官移植、免疫學(xué)的研究。5．檢測(cè)異常的有絲分裂和減數(shù)分裂。6．建立研究昆蟲及其它動(dòng)、植物新的分類方法?？捎糜谖锓N鑒別。7．某些傳染性疾病的病原診斷也可以用PCR法分析某些病原體（如病毒和細(xì)菌）的特異性片段及其多態(tài)性達(dá)到目的。8．對(duì)Y染色體DNA作多態(tài)性分析是父系遺傳研究的有力工具。第23頁/共28頁西紅花及其偽冒品的RAPD指紋圖1.Marker2.西班牙紅花3.印度紅花4.川紅花5.蓮須6.玉米須7.黃花菜第2