DNA的復(fù)制與修復(fù)_第1頁
DNA的復(fù)制與修復(fù)_第2頁
DNA的復(fù)制與修復(fù)_第3頁
DNA的復(fù)制與修復(fù)_第4頁
DNA的復(fù)制與修復(fù)_第5頁
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文檔簡(jiǎn)介

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA的復(fù)制與修復(fù)目錄第一節(jié)DNA的復(fù)制(DNA指導(dǎo)下的DNA合成)第二節(jié)DNA的損傷與修復(fù)第三節(jié)DNA突變第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄作用(RNA指導(dǎo)下的DNA的合成)第五節(jié)DNA的遺傳重組第1頁/共39頁第一節(jié)DNA的半保留復(fù)制

一、概念和實(shí)驗(yàn)依據(jù)二、DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類三、DNA的復(fù)制的起始點(diǎn)和方式四、原核細(xì)胞DNA的復(fù)制過程五、DNA復(fù)制的忠實(shí)性六、真核細(xì)胞DNA的復(fù)制

第2頁/共39頁DNA的半保留復(fù)制的概念

DNA在復(fù)制時(shí),兩條鏈解開分別作為模板,在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈,以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代,另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?,這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。第3頁/共39頁DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA第4頁/共39頁復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖

(Cairns實(shí)驗(yàn))

將3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA,經(jīng)過近兩代的時(shí)間,3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉,使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來,放射自顯影,得到上圖。非復(fù)制部分(C)銀粒子密度較低,由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分站整個(gè)染色體的三分之二,其中一條雙鏈(B

)僅有一股鏈?zhǔn)菢?biāo)記的,另外一股雙鏈(A

)的兩股鏈都是標(biāo)記的,銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長(zhǎng)約為1100微米。ABC環(huán)狀DNA的復(fù)制ABC第5頁/共39頁原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類

(1)DNA聚合酶(DNApolymerase)(2)引物酶(primase)和引發(fā)體(primosome)

:?jiǎn)?dòng)RNA引物鏈的合成。

(3)DNA連接酶(DNAligase)(4)DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5)單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB):結(jié)合在解開的DNA單鏈上,防止重新形成雙螺旋。

(6)拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力,能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài),便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物第6頁/共39頁DNA聚合酶催化的鏈延長(zhǎng)反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈第7頁/共39頁大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109,000400+++1120,000100++-0.05400,00010-20++-50比較項(xiàng)目DNA聚合酶III切除引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制功能

1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶IV和V,它們涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)(errorpronerepair)第8頁/共39頁DNA聚合酶的3′-5′外切酶水解位點(diǎn)3′3′5′5′錯(cuò)配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)第9頁/共39頁DNA聚合酶5′-3′外切酶活力

5′-3′核酸外切酶水解位點(diǎn)單鏈缺口5′第10頁/共39頁大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能延長(zhǎng)因子DNA聚合酶Ⅲ兩個(gè)亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體核心酶校對(duì)引物的結(jié)合和識(shí)別促使核心酶二聚化第11頁/共39頁連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD+AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈第12頁/共39頁DNA的雙向和單向復(fù)制環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的Q結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制第13頁/共39頁大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型第14頁/共39頁原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的延長(zhǎng)DNA鏈終止5′RNA引物3′3′第15頁/共39頁聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶II-夾子-聚體-夾子-復(fù)合物RNA引物單鏈結(jié)合蛋白(SSB)第16頁/共39頁大腸桿菌染色體復(fù)制的終止oric復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉1復(fù)制叉1復(fù)制叉2完成復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶連鎖染色體第17頁/共39頁復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶第18頁/共39頁復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程,據(jù)估計(jì),大腸桿菌DNA復(fù)制5109堿基對(duì)僅出現(xiàn)一個(gè)誤差,保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):

DNA聚合酶的高度專一性(嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則,但錯(cuò)配率為710-6

DNA聚合酶的校對(duì)功能(錯(cuò)配堿基被3’-5’

外切酶切除)起始時(shí)以RNA作為引物第19頁/共39頁DNA聚合酶的校對(duì)功能

5′-核酸外切酶3′-核酸外切酶裂縫聚合中心裂縫內(nèi)部第20頁/共39頁DNA聚合酶的校對(duì)功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸第21頁/共39頁起始時(shí)以RNA作為引物的作用

DNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物,而后又把這個(gè)引物消除呢?這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校對(duì)復(fù)制過程中的核苷酸,也就是說聚合酶在開始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前,總是檢查前一個(gè)堿基是否正確,這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來開始DNA的合成,并以核糖核苷酸來表示是“暫時(shí)”的,當(dāng)DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除,以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之,確保復(fù)制的忠實(shí)性。第22頁/共39頁真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)真核生物的DNA聚合酶端粒(telemere)復(fù)制第23頁/共39頁真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶110-23,000多個(gè)細(xì)胞核~80%無120,000一個(gè)細(xì)胞核和線粒體2~15%無-400,000一個(gè)細(xì)胞核+10~25%5-3外切酶DNA聚合酶DNA聚合酶45,000一個(gè)細(xì)胞核10~15%無第24頁/共39頁端粒酶(telomerase)DNA復(fù)制需要引物,但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機(jī)制合成末端序列,染色體就會(huì)在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清,端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物,實(shí)質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,它能催化互補(bǔ)于RNA模板的DNA片段的合成,使復(fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明,人體中生殖細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度保持不變,而體細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度則隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對(duì)此的一個(gè)推論是:人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力,體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑會(huì)有助于對(duì)生命衰老的認(rèn)識(shí)。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶第25頁/共39頁端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進(jìn)一步加工繼續(xù)延伸第26頁/共39頁真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較第27頁/共39頁第二節(jié)

DNA的損傷與修復(fù)

某些物理化學(xué)因子,如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等,都有引起生物突變和致死的作用,其機(jī)理是作用于DNA,造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞,稱為DNA的損傷.DNA的修復(fù)主要有以下類型:暗修復(fù)四、誘導(dǎo)修復(fù)(SOS修復(fù))一、光裂合酶修復(fù)二、切除修復(fù)三、重組修復(fù)

第28頁/共39頁DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放第29頁/共39頁DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯(cuò)配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代第30頁/共39頁DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制DNA聚合酶DNA連接酶重組第31頁/共39頁SOS反應(yīng)的機(jī)制未誘導(dǎo)的細(xì)胞靶基因lexA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏recA基因被LexA

蛋白質(zhì)部分阻遏(40個(gè)不同的位點(diǎn)被阻遏)LexA(阻遏物)

RecA(輔蛋白酶)靶基因表達(dá)lexA靶基因表達(dá)但產(chǎn)物被分解recA大量表達(dá)RecA促使分解LexA誘導(dǎo)的細(xì)胞單鏈DNAATP第32頁/共39頁

第三節(jié)DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變,從而導(dǎo)致DNA的復(fù)制以及后來的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化,表現(xiàn)出異常的遺傳特性,稱為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯(cuò)配得不到修復(fù)而引起的突變,以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。二、誘變劑的作用堿基類似物(baseanalog)

堿基修飾劑(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)一、突變的類型

堿基對(duì)的置換(substitution)

移碼突變(framesshiftmutation)第33頁/共39頁

DNA突變的類型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對(duì)的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT第34頁/共39頁第四節(jié)

逆轉(zhuǎn)錄作用一、概念二、逆轉(zhuǎn)錄酶三、病毒逆轉(zhuǎn)錄過程四、逆轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義擴(kuò)充了中心法則有助于對(duì)病毒致癌機(jī)制的了解與真核細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)育有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶是分子生物學(xué)重要工具酶三種功能依賴DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力依賴RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H

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