DNA測(cè)序技術(shù)總結(jié)

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA測(cè)序技術(shù)總結(jié)一、DNA序列測(cè)定的意義二、測(cè)序技術(shù)的建立三、DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展四、DNA測(cè)序技術(shù)的展望五、DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用第1頁(yè)/共45頁(yè)

DNA的序列測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。一、DNA序列測(cè)定的意義第2頁(yè)/共45頁(yè)

人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式啟動(dòng)，其主要目標(biāo)有：識(shí)別人類DNA中所有基因（超過10萬個(gè)）；測(cè)定組成人類DNA的30億堿基對(duì)的序列；將這些信息儲(chǔ)存到數(shù)據(jù)庫(kù)中；開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會(huì)問題。已于2003年完成。人類基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。造福人類的HGP第3頁(yè)/共45頁(yè)1949年,FrederickSanger開發(fā)了測(cè)定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術(shù),1953年測(cè)定了胰島素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白質(zhì)的N端測(cè)序技術(shù),后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。1965年，Sanger等發(fā)明了RNA的小片段序列測(cè)定法,并完成了大腸桿菌5SrRNA的120個(gè)核苷酸的測(cè)定。同一時(shí)期,Holley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA的序列測(cè)定。蛋白質(zhì)和RNA的測(cè)序技術(shù)二、測(cè)序技術(shù)的建立第4頁(yè)/共45頁(yè)1975年，Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測(cè)定DNA序列。1977年，Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了雙脫氧鏈終止法,使得DNA序列測(cè)定的效率和準(zhǔn)確性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert報(bào)道了化學(xué)降解法測(cè)定DNA的序列。DNA測(cè)序技術(shù)的建立第5頁(yè)/共45頁(yè)DNA序列測(cè)定技術(shù)出現(xiàn)后,迅速超越了蛋白質(zhì)和RNA測(cè)序技術(shù),成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的技術(shù)。第6頁(yè)/共45頁(yè)三、DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展第一代DNA測(cè)序技術(shù)第二代DNA測(cè)序技術(shù)第三代DNA測(cè)序技術(shù)第7頁(yè)/共45頁(yè)1、第一代DNA測(cè)序技術(shù)第一代DNA測(cè)序技術(shù)：傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測(cè)序技術(shù)。第一代DNA測(cè)序技術(shù)包括：化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法、熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)和雜交測(cè)序技術(shù)。第8頁(yè)/共45頁(yè)1.1化學(xué)降解法基本原理:利用特異的選擇性試劑，專一性的隨機(jī)斷裂DNA成不同長(zhǎng)短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類，從而測(cè)出DNA的序列。第9頁(yè)/共45頁(yè)

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序技術(shù)路線第10頁(yè)/共45頁(yè)堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對(duì)N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時(shí),可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)第11頁(yè)/共45頁(yè)第12頁(yè)/共45頁(yè)化學(xué)降解法剛問世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡(jiǎn)便快速的Sanger法所代替。第13頁(yè)/共45頁(yè)1.2雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法。該法的原理是：利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對(duì)原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長(zhǎng)短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按5′→3′方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列。第14頁(yè)/共45頁(yè)

POHdNTPddNTP

POHOH

P

P

P

POH第15頁(yè)/共45頁(yè)雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序原理示意圖

第16頁(yè)/共45頁(yè)Sanger法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測(cè)序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。第17頁(yè)/共45頁(yè)1.3熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)，從而大大提高了DNA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自動(dòng)測(cè)序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測(cè)序儀。如ABI3730XL測(cè)序儀擁有96道毛細(xì)管，4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標(biāo)記，在通過毛細(xì)管時(shí)不同長(zhǎng)度的DNA片段上的4種熒光基團(tuán)被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCD檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別，并直接翻譯成DNA序列。第18頁(yè)/共45頁(yè)目前所用自動(dòng)測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)第19頁(yè)/共45頁(yè)3730

全自動(dòng)測(cè)序儀第20頁(yè)/共45頁(yè)1.4雜交測(cè)序技術(shù)該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測(cè)的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測(cè)的成本，具有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測(cè)定。第21頁(yè)/共45頁(yè)通過幾十年的逐步改進(jìn),第1代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以超過1000bp,原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%,測(cè)定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000堿基。第22頁(yè)/共45頁(yè)第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作用,如人類基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA測(cè)序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動(dòng)測(cè)序儀仍被廣泛地應(yīng)用。隨著人類基因組計(jì)劃的完成,人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代,即功能基因組時(shí)代,傳統(tǒng)的測(cè)序方法已經(jīng)不能滿足深度測(cè)序和重復(fù)測(cè)序等大規(guī)?；蚪M測(cè)序的需求,這促使了新一代DNA測(cè)序技術(shù)的誕生。新一代測(cè)序技術(shù)即第二代測(cè)序技術(shù)。第23頁(yè)/共45頁(yè)2、第二代DNA測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GSFLX測(cè)序平臺(tái)、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測(cè)序平臺(tái)和ABI公司的SOLiD測(cè)序平臺(tái)。第二代測(cè)序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序,使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或基因組深度測(cè)序變得方便易行。第24頁(yè)/共45頁(yè)第二代測(cè)序技術(shù)將片段化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭,隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個(gè)空間固定的PCR克隆陣列。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫(kù)片段的多個(gè)拷貝組成。然后進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)。由于所有的克隆都在同一平面上,這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行,每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行,從而獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測(cè)不斷重復(fù),最后經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析就可以獲得完整的DNA序列信息。

第二代測(cè)序技術(shù)包括：454測(cè)序技術(shù)、Solexa測(cè)序技術(shù)和SOLiD測(cè)序技術(shù)。第25頁(yè)/共45頁(yè)2.1454測(cè)序技術(shù)

原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的。第26頁(yè)/共45頁(yè)第27頁(yè)/共45頁(yè)454生命科學(xué)公司在2005年最早推出了第二代測(cè)序平臺(tái)GenomeSequencer20，并測(cè)序了支原體Mycoplasmagenitalium的基因組。并在2007年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)一GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。羅氏在2005年便與454公司洽談并購(gòu)事宜，2007年完成并購(gòu)，緊接著公布了DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一——沃森(JimWatson)的個(gè)人基因組，測(cè)序總花費(fèi)不到一百萬美元。第28頁(yè)/共45頁(yè)2.2Solexa測(cè)序技術(shù)

核心技術(shù)：“DNA簇”和“可逆性末端終止”。原理：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flowcell上形成了數(shù)以億計(jì)Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。Illumina公司的新一代測(cè)序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測(cè)序(SequencingbySynthesis)的原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平行測(cè)序。第29頁(yè)/共45頁(yè)GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫(kù)構(gòu)建過程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到2×50bp，每次運(yùn)行后可獲得超過20GB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性價(jià)比較高的新一代測(cè)序技術(shù)。第30頁(yè)/共45頁(yè)SOLID通過連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫(kù)準(zhǔn)備擴(kuò)增微珠與玻片連接連接測(cè)序超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基兇組覆蓋度。2.3SOLiD測(cè)序技術(shù)第31頁(yè)/共45頁(yè)第32頁(yè)/共45頁(yè)3、第三代DNA測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)。如生物科學(xué)公司(BioScienceCorporation)的HeliScope單分子測(cè)序儀(HeliScopeSingleMolecularSequencer)以及正在研制的太平洋生物科學(xué)公司(PacificBiosciences)的單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)[SingleMoleculeRealTime(SMRT)DNAsequencingtechnology]和牛津納米孔技術(shù)公司(OxfordNanoporeTechnologiesLtd)的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)等。第33頁(yè)/共45頁(yè)

目前,我國(guó)也啟動(dòng)了第三代測(cè)序技術(shù)的研究。2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所—浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”,利用各自的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合研發(fā)國(guó)產(chǎn)第三代測(cè)序儀,第一臺(tái)樣機(jī)預(yù)計(jì)2013年問世,屆時(shí)有望緩解測(cè)序儀核心技術(shù)受制于國(guó)外公司的現(xiàn)狀。第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用,但是由于其測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測(cè)序解決方案。單分子測(cè)序也就應(yīng)運(yùn)而生。第34頁(yè)/共45頁(yè)第三代測(cè)序技術(shù)非常驚人！1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基，但是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。4、可直接測(cè)RNA序列。5、可直接測(cè)甲基化的DNA序列。第35頁(yè)/共45頁(yè)

2008年4月，HelicoBioScience公司的Timothy等人在Science上報(bào)道了他們開發(fā)的真正的單分子測(cè)序技術(shù),并利用該技術(shù)對(duì)一個(gè)M13病毒基因組進(jìn)行重測(cè)序。這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測(cè)序,是因?yàn)樗耆邕^了前述3種高通量測(cè)序依賴的基于PCR擴(kuò)增的信號(hào)放大過程,真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力。斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最近利用Heliscope單分子測(cè)序儀,用了48000美元的試劑和4個(gè)星期的時(shí)間,對(duì)一名白人男子的基因組進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序的覆蓋度達(dá)28倍,覆蓋了90%的人類參考基因組。序列讀長(zhǎng)24-70bp,平均讀長(zhǎng)為32bp,并鑒定出280萬個(gè)SNP位點(diǎn)和752個(gè)拷貝數(shù)變異。3.1HeliScope單分子測(cè)序儀第36頁(yè)/共45頁(yè)P(yáng)acificbioscience在Science上報(bào)道了他們的基于SMART技術(shù)的單分子測(cè)序技術(shù),該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶,在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測(cè)序產(chǎn)物,目前一期的讀取速度為3bp/s,但他們聲稱在2013前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。Pacific技術(shù)目前在研究大腸桿菌基因組時(shí)的評(píng)價(jià)讀長(zhǎng)為586個(gè)堿基,有些能達(dá)到2805堿基,新儀器的單個(gè)讀長(zhǎng)已達(dá)10351個(gè)堿基,而且有望實(shí)現(xiàn)更大的讀長(zhǎng),而且準(zhǔn)確率＞99.9999%。3.2單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)第37頁(yè)/共45頁(yè)英國(guó)牛津納米公司成功研制出了基于納米孔的單分子測(cè)序技術(shù),該技術(shù)讀取數(shù)據(jù)的速度更快,而且成本會(huì)大大降低

。在該測(cè)序技術(shù)平臺(tái)中,DNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過納米小孔,利用核酸外切酶的特性來識(shí)別出不同的DNA堿基,同時(shí)還能檢測(cè)出堿基是否被甲基化等相關(guān)的重要信息。3.3納米孔單分子測(cè)序技術(shù)第38頁(yè)/共45頁(yè)據(jù)2010年7月30日XiaoYan（NanoLett，July30，2010）報(bào)道，美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員開發(fā)出一個(gè)納米級(jí)的碳基平臺(tái)，可用于電子探測(cè)單個(gè)DNA分子。該技術(shù)最終有望在快速DNA電子測(cè)序方面發(fā)揮“用武之地”。這個(gè)納米平臺(tái)由石墨烯制成。研究小組利用電子束技術(shù)，在石墨烯膜上燒灼出納米大小的小孔，在電場(chǎng)的作用下，微小的DNA鏈就可以穿過這些孔洞。通過電子測(cè)量手段檢測(cè)DNA的易位，再根據(jù)DNA的4個(gè)堿基各自獨(dú)特的“電子簽名”，就可以快速完成DNA測(cè)序。探測(cè)單個(gè)DNA分子技術(shù)開啟高通量DNA電子測(cè)序之門第39頁(yè)/共45頁(yè)第40頁(yè)/共45