人二倍體細胞建株

人二倍體細胞建株、檢定及制備疫苗規(guī)

程人二倍體細胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗等。[B]A細胞株的要求[/B]用于疫苗生產(chǎn)的人二倍體細胞株（以下簡稱細胞株）須按下列規(guī)定進行全面檢定。新建立細胞株，應按《新生物制品審批辦法》進行審批。1建立細胞株必須具備下列資料1.1建立細胞株所用的胎兒的胎齡和性別，中止妊娠原因。1.2建立細胞株所用胎兒的父、母年齡、職業(yè)及健康狀況，胎兒父、母系三代應無明顯遺傳缺陷和腫瘤疾病歷史。在取胎兒組織時，應作出詳細調(diào)查，報衛(wèi)生部審批前，應進行一次重復調(diào)查。1.3原始組織種類，原代培養(yǎng)的數(shù)量與生長狀況。1.4細胞培養(yǎng)史和生長特征，細胞壽命、世代數(shù)。1.5細胞生長液的成分。2細胞株的檢定2.1染色體的鑒定和制片細胞原系建株過程，每8?12世代*應作一次染色體檢查，一株細胞整個生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中，至少應有4?5次染色體檢查結(jié)果。每次染色體檢查，應從同一世代不同細胞培養(yǎng)瓶中取細胞混合再培養(yǎng)，制備染色體標本片。染色體標本應長期保存（直至褪色不能用為止），以備復查。每次染色體檢查，至少應隨機取1000個分裂中期細胞，進行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查，并作出有助于復查的記錄，其中至少選擇50個分裂中期細胞進行顯微照相，作出核型分析。并應粗數(shù)500個分裂中期細胞，檢查多倍體的發(fā)生率?？梢訥分帶或Q分帶技術(shù)檢查50個中期細胞染色體帶型，應用照相圖片作出帶型分析。以顯帶技術(shù)檢出的核型異常（假二倍體、倒位、易位等）發(fā)生率應用比現(xiàn)用上限更寬的基本數(shù)據(jù)進行評價，合格上限尚未定出。1000個和500個中醫(yī)細胞標本中，檢查異常率、合格的上限（可信限95%,Poison法）如表1。表1異常檢查細胞數(shù)（個）1000500100染色單體和染色體斷裂47268結(jié)構(gòu)異常17102超二培性852亞二倍性*1809018多倍性**30174*亞二倍性超過上限時，可選用批標本片重數(shù)**+一個中期細胞內(nèi)超過53條染色體即為一個多倍體2.1.2染色體制片要求應及時進行制片質(zhì)量檢查，如發(fā)現(xiàn)細胞堆積，染色體分散不好等，由于技術(shù)原因不適于讀片時，可以及時重新制片。但已經(jīng)讀片后，不斷因某項超過標準（亞二位性除外）而廢棄不算。如考慮到制片技術(shù)與質(zhì)量問題，可重試兩次，當有一次結(jié)果與原結(jié)果相近時，又無可知原因，應以原結(jié)果為準。2.2外源因子檢查細胞株不應有細菌、霉菌、支原體和病毒等污染。每8?12世代細胞培養(yǎng)物，應進行下列檢查。2.2.1細菌、霉菌、支原體檢查按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。2.2.2病毒檢查2.2.2.1細胞直接觀察及紅細胞吸附試驗取混合瓶細胞樣品，接種小瓶或小管，長成單層后更換維持液，觀察2周，鏡檢細胞，應保持正常形態(tài)特征。培養(yǎng)7天，用0.2%?0.5%雞和豚鼠混合紅細胞懸液進行紅細胞吸附試驗，先置于4?8°C，后置于20?25°C，各30分鐘，兩次觀察結(jié)果均應為陰性。細胞培養(yǎng)的上清液混合樣品，至少接種4種細胞（原代人腎或猴腎細胞、原代兔腎細胞、人源傳代細胞和另一批人二倍體細胞）。接種的樣品量應占維持液的20%以上，于培養(yǎng)5?7天和14天時，進行紅細胞吸附試驗（見2.2.2.1項）。培養(yǎng)7天的上清液在同種細胞培養(yǎng)上盲傳一代，觀察14天，應無細胞病變，紅細胞吸附試驗應為陰性（在該試驗的細胞維持液中，允許加入少量該細胞培養(yǎng)用的牛血清，以利細胞維持和觀察）。2.2.2.3動物試驗檢查用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和雞胚各一組。每組動物或雞胚接種受檢細胞不應少于107。按表2所列要求進行試驗和觀察。如80%以上動物和雞胚健存，此試驗為通過。2.2.2.4其他檢查細胞株傳代過程中，至少于2個不同世代水平進行包涵體、乙型肝炎表面抗原及電鏡檢查，結(jié)果均應為陰性。2.3腫瘤原體檢查每8?12世代做一次細胞株的異種移植試驗，觀察細胞株有無致腫瘤性質(zhì)，每次實驗使用6只乳鼠（3?5日齡）或體重8?10g小白鼠，經(jīng)抗胸腺血清（ATS）處理，皮下接種活二倍體細胞（最適傳代的細胞），觀察14天，檢查有無結(jié)節(jié)形成。有結(jié)節(jié)或可疑病灶時，做病理切片檢查。試驗同時，用HeLa或其他人源傳代細胞系做陽性對照試驗，用動物數(shù)與處理方法同試驗組，接種被檢二倍體細胞數(shù)應為對照腫瘤細胞數(shù)的5倍以上。結(jié)果二倍體細胞株不應有移植瘤形成，而對照組細胞則應有80%或更多的動物有典型移植瘤出現(xiàn)（腫瘤結(jié)節(jié)需經(jīng)病理組織學診斷）。表2動物組別要求動物或雞胚數(shù)接種途徑接種細胞懸液量（ml/只）觀察天數(shù)結(jié)果乳鼠24小時內(nèi)2窩N10腦內(nèi)腹腔0.010.121應健存成鼠12?14g10腦內(nèi)腹腔0.030.521應健存豚鼠350?500g5腹腔5.042應健存，解剖無結(jié)核病變家兔1.5?2.5kg5皮內(nèi)皮下0.1X10**9.021無異常健存雞胚9?11日齡10尿囊腔0.23?4尿液血凝試驗陰性****豚鼠于注射前及觀察4周作舊結(jié)核菌素試驗，應為陰性**每只于背部皮內(nèi)注射10處，每處0.1ml***應用豚鼠和雞混合紅細胞作直接血凝試驗可以用任何以免疫抑制劑處理，并對腫瘤細胞有同樣敏感性的其他動物試驗，如無胸腺小白鼠（nudenu/nu基因型等）。3細胞種子細胞株傳代過程的早期，應選定適應世代數(shù)培養(yǎng)出大量細胞，制成懸液，分裝安瓿作為細胞種子。置液氮中凍存，以備細胞株建成后，大量供應細胞。凍存的種子細胞活存率應在60%以上。凍存后一定時間，應至少復蘇培養(yǎng)一系全衰老期，并在不同傳代水平，檢查細胞株的生長、胞核學特征、異種移植等，證明細胞經(jīng)凍存后的生物學性質(zhì)無明顯改變。[B]B二倍體細胞用于疫苗生產(chǎn)的要求[/B]細胞細胞株用于疫苗生產(chǎn)的細胞株，必須符合本規(guī)程要求。不含外源因子、核型正常、對病毒敏感和具有足夠多的細胞種子?？捎肒MB-17、2BS等細胞株。所用細胞株均須經(jīng)衛(wèi)生部批準。1.2細胞種子批一個細胞種子批應有足夠量早世代細胞，分裝安瓿保存于液氮中，作為細胞種子。生產(chǎn)用細胞種子批用一個或數(shù)個細胞種子安瓿傳代增殖到適宜世代，具有一定量的均一細胞懸液，分裝安瓿，標明世代、安瓿號和凍存的日期，保存于液氮中，作為生產(chǎn)用細胞種子。生產(chǎn)用細胞種子批檢定2.1.1細菌、霉菌、支原體檢查按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。用生產(chǎn)用細胞種子世代水平或至2/3世代壽命水平的細胞作檢定樣品。用下列動物和雞胚檢查：TOC\o"1-5"\h\z乳鼠（24小時內(nèi)）2窩最少 10只成鼠 12?14g 10只豚鼠 350?500g 5只家兔 1.5?2.5kg 5只雞胚 9?11日齡10只各種動物和雞胚的接種法、觀察期，按照A2.2.2.3條進行。2.1.3腫瘤原性檢查按A2.3項執(zhí)行。2.1.4染色體的監(jiān)測檢查用于生產(chǎn)的最后一個世代或其后任一世代，至少檢查500個中期細胞的多倍性、染色體精確計數(shù)、斷裂率、結(jié)構(gòu)異常及其他異常發(fā)生率，例如螺旋消失或初級次縊痕或次級次縊痕的明顯減弱等。按A2.1.1項進行評價。生產(chǎn)用細胞庫細胞染色體監(jiān)測用的染色體標本片和照片，應作為該細胞批監(jiān)測此細胞生產(chǎn)疫苗批的記錄，永久保存。3生產(chǎn)用細胞的培養(yǎng)3.1從生產(chǎn)用細胞種子開始傳代培養(yǎng)，以適宜分種率連續(xù)傳代，直至增殖足夠量的細胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)。用于生產(chǎn)的細胞世代，應在細胞整個壽命期的前2/3世代內(nèi)。3.2細胞外源因子檢查于種毒當天，或在連續(xù)傳代種毒，于最后一次細胞種毒當天，此批細胞留取2%?5%不種毒，換維持液作為正常細胞對照，以檢查外源因子。從換液之日起觀察2周，細胞應無異常變化。用換維持液0?2天的對照細胞上清液，接種原代兔腎、非人靈長類傳代細胞及另一批人二倍體細胞，接種樣品量應占維持液的20%。觀察14天，換液后5?8天用上清液，在相應細胞盲代一代，觀察14天，做血吸附試驗。在收毒時，用0.2%?0.5%雞和豚鼠紅細胞，在2?8°C和20?25°C做血吸附試驗，應為陰性。在生產(chǎn)用細胞世代水平或其后數(shù)代，檢查300個中期細胞，計數(shù)多倍體，作100個中期細胞染色體檢查，應核型正常，鑒別確為本細胞無誤。除染色體監(jiān)測外，還可用