免疫檢驗第十三章免疫細胞分離與檢測

免疫檢驗第十三章免疫細胞分離與檢測第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日密度梯度離心(Ficoll)離心第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、淋巴細胞分離（去單核細胞）貼壁粘附法

（單核細胞貼壁生長的特點、將懸液置玻璃或塑料器皿，未貼壁的為淋巴細胞，此法易造成B流失）吸附柱過濾法

（單核細胞貼壁生長的特點，將細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠的層析柱中，洗脫下來的為淋巴細胞）

Percoll分離液法

（連續(xù)密度梯度離心，不同密度的細胞懸浮于各自不同的密度區(qū)帶）第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日Percoll法分離單個核細胞中各細胞成分的分布示意圖第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日E花環(huán)沉降法（T細胞與綿羊紅細胞形成E花環(huán)后用淋巴細胞分層液分離，E花環(huán)沉在管底）尼龍毛柱分離法（B細胞和單核細胞易粘附于尼龍纖維表面，將用HANKS液浸泡后的單個核細胞懸液加入充填有尼龍毛的聚乙烯塑料管內，洗脫液中為T細胞，然后邊沖邊擠壓塑料管，洗下B細胞。

三、T、B細胞和T細胞亞群的分離第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日大小免疫磁珠分離細胞的特點比較

比較項目大磁珠小磁珠對細胞的影響對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利于分離后培養(yǎng)。對細胞溫和，不影響分離細胞的后續(xù)培養(yǎng)。對流式細胞儀的影響阻塞流式細胞儀的噴嘴，影響散射光?？芍苯由狭魇郊毎麅x檢測，不影響散射光。分離條件要求技術簡單，分離可在試管中完成。需要很強的磁場來分離細胞。收率得率高。得率不高。純度純度低。純度高。分離時間分離速度快。分離速度慢。分離成本成本低。需要很強的磁場來分離細胞，需要一次性的分離柱，不能在普通試管進行。第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)淋巴細胞表面標志的檢測及亞群分類

常用于鑒定和檢測淋巴細胞表面標志是簇分化抗（CD）。

一、T細胞表面標志及其亞群

CD3+CD4+CD8-輔助性T細胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞（regulatoryTcell,TrorTreg）第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日輔助性T細胞Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-β

CD3+CD4+CD30-)Th2（IL-4、IL-5、IL-6或IL-10

CD3+CD4+CD30+）第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日細胞毒性T細胞Tc1（CD3+CD8+CD30-)Tc2（CD3+CD8+CD30+）第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日調節(jié)性T細胞CD4+CD25+調節(jié)性T細胞CD8+調節(jié)性T細胞第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日二、B細胞表面標志

SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體、小鼠紅細胞受體都是B細胞的重要表面標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標。

成熟B細胞的mIg主要為mIgM、mIgD。CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。

人類NK細胞表面標志主要以CD16、CD56來認定，臨床上將CD3-CD16+CD56+淋巴細胞認定為NK細胞。三、NK細胞表面標志

第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)抗原提呈細胞表面標志的檢測抗原提呈類細胞表面標志第四節(jié)淋巴細胞功能檢測

淋巴細胞功能測定可分為體內實驗和體外實驗。

體內實驗主要是進行遲發(fā)型超敏反應，間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應.

體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定.第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日淋巴細胞分類T細胞（負責細胞免疫功能）B細胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK和K細胞（非特異性免疫作用）第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.原理：淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質疏松（一）T淋巴細胞增殖試驗第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日

未轉化和轉化淋巴細胞的形態(tài)特征轉化的淋巴細胞未轉化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.淋巴細胞轉化的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細胞

ConA-------T細胞

PWM-------T、B細胞

LPS-------B細胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日

同位素法：PHA

淋巴細胞（54h）

DNA合成期+3H-TdR摻入

收集細胞

檢測β射線

測定細胞內的3H-TdR3.檢測方法形態(tài)法：刺激物淋巴細胞（4-6天）母細胞化第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日（1）形態(tài)學檢查法第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日方法學評價：優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結果，適于基層實驗室應用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日（2）3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。缺點：但需一定設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。（3）MTT比色法第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日(二)T細胞分泌功能測定

體外培養(yǎng)的T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學、細胞生物學及分子生物學技術分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。

第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.原理：靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞（三）T細胞介導的細胞毒試驗第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日形態(tài)學方法：淋巴細胞+腫瘤細胞計數(shù)殘留腫瘤細胞同位素法：淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr

釋放測定γ射線2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力

第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日(四)體內試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗二、B細胞功能檢測溶血空斑試驗B細胞抗體形成功能的檢測體內試驗第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.方法學：經(jīng)典溶血空斑形成試驗被動溶血空斑試驗

(一)溶血空斑試驗溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。

第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日應用與方法學評價：該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。(二)酶聯(lián)免疫斑點法第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日三、NK細胞活性測定靶細胞溶解常用靶細胞:

K562細胞株(人）

YAC-1細胞株(小鼠）第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學發(fā)光法染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細胞熒光測CPM值測發(fā)光強度方法學及原理第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日

吞噬細胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應的檢測方法。一、中性粒細胞功能檢測技術二、巨噬細胞功能檢測技術第五節(jié)其他免疫細胞功能檢測技術第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日一、中性粒細胞功能的檢測