免疫細胞的分離與檢測

免疫細胞的分離與檢測第一頁，共七十五頁，2022年，8月28日一、免疫細胞的特征1、免疫細胞的形態(tài)學(xué)特征理化性狀生物學(xué)特性2、免疫細胞的膜分子特征

CD分子第二頁，共七十五頁，2022年，8月28日第三頁，共七十五頁，2022年，8月28日NKcells吞噬溶酶體第四頁，共七十五頁，2022年，8月28日第五頁，共七十五頁，2022年，8月28日二、免疫細胞的分離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其他分離法第六頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、密度梯度離心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分層液Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，親水性高，平均分子量為400,000，當密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。

第七頁，共七十五頁，2022年，8月28日離心前離心后稀釋抗凝血淋巴細胞分離液血漿單個核細胞粒細胞紅細胞第八頁，共七十五頁，2022年，8月28日2、黏附分離法-純淋巴細胞群的分離貼壁法：將已制備的單個核細胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細胞和粒細胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細胞幾乎為純淋巴細胞，繼用橡皮刮下貼壁的細胞即為純單核細胞群。因B細胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細胞群中B細胞有所損失。第九頁，共七十五頁，2022年，8月28日2、黏附分離法：淋巴細胞亞群的分離尼龍毛法：混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細胞群的有效方法。

T細胞得率為20-30%左右。親和板法：利用親和層析法分離淋巴細胞亞群，其原理是各種淋巴細胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細胞懸液，凡抗原陽性的細胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細胞可從未吸附的細胞懸液中獲取。吸附柱法：將單個核細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細胞主要是淋巴細胞。此法簡單易行，對細胞極少損害。第十頁，共七十五頁，2022年，8月28日3、熒光激活分離法（FACS）第十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日流式細胞儀第十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日4、磁性分離法（1）磁鐵吸引法：利用單核細胞具有吞噬的特性，在單個核細胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時旋轉(zhuǎn)搖動，待單核細胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細胞。（2）磁激活細胞分離術(shù)MACs：是一種特異性細胞分選技術(shù)，其高度特異性來自抗體對抗原的特異性識別。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。MACS微珠是與高度特異性單克隆抗體相偶聯(lián)的超順磁化微粒。MACS分選柱置于一個永久性磁場—MACS分選器中，可以將磁力增強1000倍，足以滯留僅標記極少量微珠的目的細胞。用緩沖液沖洗分選柱，所有未標記的細胞被沖洗掉。分選柱離開磁場，即可獲得被標記的細胞組分。第十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日MACS(陽性選擇法）NS第十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日MACS(陰性選擇法）NS第十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日第十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日5、其他分離法花環(huán)沉降法：本法是將淋巴細胞與一定比例的綿羊紅細胞混合，待淋巴細胞形成E花環(huán)后，繼用淋巴細胞分層液分離細胞。浮懸在分層界面而不形成E花環(huán)的群則富含B細胞，而沉降在管底的形成E花環(huán)的細胞用低滲法處理，使圍繞細胞周圍的綿羊紅細胞快速裂解，則獲得純的T細胞。可溶性MHC-肽四聚體法：mhc-肽四聚體復(fù)合物的原理是通過增強t細胞受體與mhc-肽復(fù)合物親和力，達到可直接特異性檢測t細胞的目的。作為臨床診斷工具，定量檢測外周血及組織中抗原特異性CTLs的比率，并進行表型及功能分析。

用于過繼性腫瘤免疫治療

用于疫苗療效的監(jiān)測第十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)T第十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日MHCI類(左)和Ⅱ類(右)分子四聚體結(jié)構(gòu)示意圖第二十頁，共七十五頁，2022年，8月28日三、細胞的凍存與復(fù)蘇1、細胞凍存的原理與方法：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，引起細胞死亡。向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。2、細胞復(fù)蘇的原理與方法：細胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。第二十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日細胞凍存罐第二十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日

第二節(jié)免疫細胞膜分子的檢測一、免疫細胞膜分子檢測的原理與類型二、免疫細胞膜分子的檢測方法第二十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日一、免疫細胞膜分子檢測的原理與類型1、以抗體識別抗原2、以配體識別受體第二十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日二、免疫細胞膜分子的主要檢測方法1、免疫標記檢測方法熒光抗體法酶免疫檢測法免疫金銀染色法2、補體依賴的細胞毒試驗（CDC）3、花環(huán)形成試驗第二十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日SmIg的熒光抗體檢測法第二十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日SmIg的酶免疫檢測法第二十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日補體依賴的細胞毒試驗（CDC）染料補體第二十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日E-花環(huán)：利用T細胞膜上的異種動物紅細胞受體T細胞B細胞花環(huán)形成細胞綿羊紅細胞第二十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日第三十頁，共七十五頁，2022年，8月28日EA-花環(huán)：B淋巴細胞表面有Fc受體，能與免疫球蛋白的Fc段結(jié)合，因此用抗體致敏的紅細胞與B淋巴細胞混合，可見B淋巴細胞周圍粘附有紅細胞第三十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日EAC-花環(huán)：B淋巴細胞表面有補體受體，在抗體致敏的紅細胞中加入補體，可形成紅細胞-抗體-補體復(fù)合物，再與B淋巴細胞混合，則可形成EAC玫瑰花環(huán)。第三十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日

第三節(jié)免疫細胞功能測定一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗二、細胞毒試驗三、抗體形成試驗四、細胞吞噬與殺傷試驗第三十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：刺激物分為非特異性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特異性刺激因子（如抗原）；檢測方法為形態(tài)學(xué)檢測法和3H-TdR摻入法及MTT法等。2、混合淋巴細胞培養(yǎng)：混合淋巴細胞培養(yǎng)(MLC)或稱混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)常用于器官移植前的組織配型，以測定受體和供體主要組織相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴細胞接受同種異型抗原的刺激而發(fā)生活化、增殖，產(chǎn)生種類眾多的細胞因子，促進NK、LAK和CTL等殺傷細胞的分化，因此又是免疫調(diào)節(jié)研究中常用的實驗?zāi)Ｐ?。一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗第三十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日第三十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日放射性測定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗原理示意小淋巴細胞在轉(zhuǎn)化為原始母細胞過程中，合成DNA增加，能夠吸收胸腺嘧啶核苷（3H）第三十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗2、ADCC作用測定3、NK活性測定二、細胞毒檢測試驗

第三節(jié)免疫細胞功能測定第三十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日放射性測定細胞毒試驗原理示意靶細胞效應(yīng)細胞分離上清第三十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日2、K細胞活性測定（ADCC活性測定）動物機體有些免疫細胞，通過抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（ADCC）殺傷靶細胞，如NK細胞、活化的T細胞、吞噬細胞等，這類細胞統(tǒng)稱為K細胞。K細胞的活性不僅反映機體細胞免疫的能力，而且與體液免疫也有直接的關(guān)系。K細胞活性檢測的方法有同位素釋放試驗法，溶血空斑法，細胞剝離法和靶細胞接合試驗。僅介紹同位素釋放法。第三十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日（1）原理將靶細胞用51Cr標記后，再與特異性的IgG抗體結(jié)合，加入K細胞后即可發(fā)生ADCC效應(yīng)，引起靶細胞的溶解并釋放51Cr。用計數(shù)儀分別檢測上清和細胞沉淀中的cpm，根據(jù)上清中釋放的51Cr的多少，可判斷K細胞活性的高低。第四十頁，共七十五頁，2022年，8月28日（2）方法1、試驗管：效應(yīng)細胞(淋巴細胞懸液)，標記的靶細胞(Cr51標記的雞紅細胞)和亞凝集單位的抗體(兔抗雞紅細胞抗體)各0.1ml，加RPMI1640完全培養(yǎng)基1.7ml（ADCC）。2、效應(yīng)細胞對照管：效應(yīng)細胞和標記的靶細胞各0.1ml加上述完全培養(yǎng)基1.8ml（未加抗體）。3、抗體對照管：標記的靶細胞和亞凝集單位的抗體各0.1ml，加完全培養(yǎng)基1.8ml（未加效應(yīng)細胞）。4、最大釋放對照管：標記的靶細胞0.1ml加蒸餾水1.9ml（靶細胞會裂解，完全釋放同位素）。5、自然釋放管：標記的靶細胞0.1ml，加完全培養(yǎng)基1.9ml（靶細胞不裂解，但可自然釋放一定量的同位素）。以上各管均置37℃5～20h后，2500g離心10min，分別取各管上清夜1.0ml置于5支試管中，用γ計數(shù)儀測各管上清和沉淀中的cpm值。第四十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日（3）結(jié)果判斷和計算51Cr實驗釋放率（%）

2×(上清cpm—本底cpm)×100%(上清cpm-本底cpm)＋(沉淀cpm-本底cpm)51Cr特異釋放率（%）

試驗釋放率—自然釋放率×100%

最大釋放率－自然釋放率

第四十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日3、NK細胞活性測定NK細胞是具有天然殺傷靶細胞活性的淋巴樣細胞，其殺傷作用不需要抗體、補體的參加，所殺傷靶細胞通常指腫瘤細胞和病毒感染或轉(zhuǎn)化的細胞。這樣，可以將來源于同種動物的腫瘤細胞系或病毒轉(zhuǎn)化的細胞系，作為檢測NK細胞活性的指示細胞。NK細胞活性測定多采用51Cr釋放法試驗，其原理同細胞毒性T細胞試驗中所采用的51Cr釋放法試驗。在這里以檢測小鼠脾臟NK細胞活性為例，說明本試驗方法。用3H-TdR摻入法，靶細胞為YAC-1細胞株（小鼠淋巴瘤細胞系）。第四十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日（1）試劑小鼠脾細胞懸液:分離單個脾臟細胞---裂解紅細胞---淋巴細胞洗滌配置懸液（1640完全培養(yǎng)基2×106/ml）。標記的靶細胞：活淋巴細胞（96%以上）加入H3-Tdr---孵育2小時/每30min振搖---洗3次---配成2×106/ml懸液。第四十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日（2）方法試驗組孔：脾細胞懸液(淋巴細胞)：標記的靶細胞懸液100:1左右；對照組：單純加標記的靶細胞。37℃5%CO2培養(yǎng)18小時（NK細胞殺傷靶細胞）；每孔加終濃度為0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37℃處理30min（消化細胞和處理掉死亡靶細胞釋放出來的放射性DNA）。各孔細胞收集后依次通過生理鹽水，5%三氯乙酸和無水乙醇（獲得了存活的靶細胞的標記DNA）。待濾膜干燥后用γ液閃計數(shù)儀測定cpm值。三、結(jié)果計算NK細胞活性以特異性殺傷率表示：特異性殺傷率（%）＝（1－試驗組cpm/對照組cpm）×100%第四十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、直接溶血空斑試驗2、間接溶血空斑試驗3、SPA-SRBC溶血空斑試驗三、抗體形成試驗第四十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、直接溶血空斑試驗第四十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日2、間接溶血空斑試驗第四十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日3、SPA-SRBC溶血空斑試驗第四十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、細胞吞噬功能試驗2、細胞殺菌功能試驗細胞吞噬與殺傷功能試驗第五十頁，共七十五頁，2022年，8月28日第五十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日吞噬百分率=吞有顆粒的吞噬細胞數(shù)計數(shù)的吞噬細胞數(shù)吞噬指數(shù)=吞噬細胞吞噬的總顆粒數(shù)計數(shù)的吞噬細胞數(shù)第五十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日NBT還原試驗原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲月簪基（紫黑色）第五十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日NBT還原試驗方法：1、抗凝血+硝基藍四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽性細胞7.5-15%第五十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日

第四節(jié)免疫細胞凋亡測定一、細胞凋亡的概念與原理二、細胞凋亡的檢測方法第五十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日

一、細胞凋亡的概念與原理1、細胞凋亡的概念2、細胞凋亡的原理3、細胞凋亡的特點第五十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日

1、細胞凋亡（apoptosis）

細胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動死亡過程，也稱程序性死亡。第五十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。壞死（necrosis）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞脹大，胞膜破裂，細胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應(yīng)。凋亡是細胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。第五十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日

凋亡壞死機制基因調(diào)控的程序化細胞死亡，主動進行（自殺性）意外事故性細胞死亡，被動進行（他殺性）誘因生理性或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如生長因子缺乏病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如缺氧、感染、中毒死亡范圍多為散在的單個細胞多為聚集的大片細胞形態(tài)特征細胞固縮，核染色質(zhì)邊集，細胞膜及各細胞器膜完整，膜可發(fā)泡成芽，形成凋亡小體細胞腫脹，核染色質(zhì)絮狀或邊集，細胞膜及各細胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細胞自溶生化特征耗能的主動過程，有新蛋白合成，DNA早期規(guī)律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀不耗能的被動過程，無新蛋白合成，DNA降解不規(guī)律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀周圍反應(yīng)不引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生，但凋亡小體可被鄰近細胞吞噬引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生第五十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日

2、細胞凋亡的原理凋亡信號——凋亡受體——信號傳導(dǎo)——凋亡基因啟動——編碼程序性死亡蛋白——細胞結(jié)構(gòu)解體——細胞凋亡第六十頁，共七十五頁，2022年，8月28日

細胞凋亡機制（動畫）第六十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日

3、細胞凋亡的特點（1）細胞皺縮（2）染色質(zhì)邊集（3）凋亡小體出現(xiàn)第六十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日

細胞凋亡第六十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日

二、細胞凋亡的檢測方法1、形態(tài)觀察法：凋亡的細胞皺縮，質(zhì)膜完整，胞漿致密，細胞器密集，不同程度退變；核染色質(zhì)致密，形成形狀不一，大小不等的團塊邊集于核膜處，進而胞核裂解；胞漿發(fā)生芽突。胞漿芽突脫落后，形成許多凋亡小體。2、生化檢測法：①胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。

②細胞內(nèi)活性氧增多。

③質(zhì)膜通透性增高。

④DNA內(nèi)切酶被激活，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成180~200bp的特征性的有序片段。

⑤Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。

3、流式細胞儀檢測法第六十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、形態(tài)觀察法（1）普通光鏡檢測HE染色甲基綠-派諾寧染色：細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要有細胞內(nèi)蛋白酶的激活，細胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達的增強。而細胞壞死是一種被動的細胞死亡過程，細胞質(zhì)內(nèi)常有RNA的損失。根據(jù)這一特點，可應(yīng)用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性，使甲基綠對固縮細胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如果細胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞，呈陰性染色者為壞死細胞。

二、細胞凋亡的檢測方法第六十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日甲基綠-派諾寧染色：光學(xué)顯微鏡下凋亡細胞和壞死細胞均表現(xiàn)為細胞固縮：其中凋亡細胞細胞核呈綠色或綠藍色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染，壞死細胞只有固縮細胞，核綠色著染，而細胞質(zhì)無染色。

第六十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日（2）熒光顯微鏡檢測—溴化丙錠（PI）染色：

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。第六十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日（3）透射電子顯微鏡：已經(jīng)用于凋亡細胞的檢測。鏡下可見凋亡細胞體積變小、細胞質(zhì)濃縮、細胞核變小、染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊，出現(xiàn)染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的核邊集現(xiàn)象。晚期的凋亡細胞，清晰可見細胞核裂解產(chǎn)生的凋亡小體。第六十八頁，共七十五頁，2022年，8月