基因工程的基本操作順序

1、基因工程至少需要哪三種工具？2、這三種工具分別起什么作用？溫故知新：1.2基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定問題1一：目的基因的獲取

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。

1.目的基因主要是指___________________編碼蛋白質(zhì)的基因什么是目的基因？2、也可以是具有調(diào)控作用的因子獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因3、人工合成目的基因已知序列未知序列(一)從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫1.基因文庫概念2.基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?

根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA、基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。(一)從基因文庫中獲取目的基因3.基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼敢欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫4.cDNA文庫的構(gòu)建提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導入受體菌中儲存反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。cDNA合成過過程是：：第一步，，反轉(zhuǎn)錄錄酶以RNA為為模板合合成一條條與RNA互補的DNA單單鏈，形形成RNA-DNA雜雜交分子子。第二步，，核酸酶酶H使RNA-DNA雜交分分子中的的RNA鏈降解，使使之變成成單鏈的的DNA。第三步，，以單鏈鏈DNA為模板板，在DNA聚聚合酶的的作用下下合成另另一條互互補的DNA鏈鏈，形成成雙鏈DNA分分子。問題2為什么用用生物發(fā)發(fā)育某個個時期的的mRNA反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄得的的DNA只有這這種生物物的部分分基因？？某個時期期的發(fā)育育是基因選擇擇性表達達的結(jié)果兩種基因因文庫的的主要區(qū)區(qū)別如下下表（課課本P10）文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少部分基因全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以總結(jié)1、概念念：PCR全稱稱為________________，，是一項項在生物____復制制_____________的核核酸合成成技術(shù)3、條件件：2、原理理：__________多聚酶鏈鏈式反應應體外特定DNA片段DNA復制(二)利利用PCR技術(shù)擴增目的的基因模板（目的基基因）原料(脫氧核核苷酸)引物（一小段段單鏈DNA））DNA聚聚合酶（（耐高溫溫）溫度控制制4、操作作前提：：一段已知知目的基基因的核核苷酸序序列，以以便合成成引物。。6、結(jié)果果。5、擴增增形式：：指數(shù)形式式（2n）在短時間間內(nèi)大量量擴增目目的基因因7、過程程：a、變性性（90℃℃-95℃）：：雙鏈DNA模模板在熱熱作用下，_____斷裂裂，形成成___________b、復性性（55℃℃-60℃）：：系統(tǒng)溫溫度降低低，引物物與DNA模模板結(jié)合合，形成成局部________。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在Taq酶的的作用下下，從引物開始始進行堿堿基互補補配對，，合成與與模板互補補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈(二)利利用PCR技術(shù)術(shù)擴增目目的基因因動畫演演示細胞內(nèi)復復制.VS.PCR擴擴增DNA母母鏈4種脫氧氧核苷酸酸TaqDNA聚合酶酶引物（2個snDNA）溫度控制制1）模板板：2）原料料：3）酶：：DNA母母鏈4種脫氧氧核苷酸酸解旋酶DNA聚聚合酶引物酶DNA連連接酶DNA增增殖4）特點點:半保留復復制邊解旋邊邊復制(不用DNA連連接酶)半保留復復制全解旋再再復制（三）通通過DNA合成成儀直接接合成目目的基因因DNA合成儀推測推測合成前提：基因比較較小、核核苷酸序序列已知知蛋白質(zhì)的的氨基酸酸順序mRNA核苷酸酸序列基因DNA的核核苷酸序序列目的基因問題43、如果果不知道道目的基基因的核核苷酸序序列，可可采用_________________獲取目的基因因的三種方法法應用1、如果知道道目的基因兩兩端的核苷酸酸序列，而且且基因比較大大，可采用____________2、如果知道道目的基因的的序列，而且且基因比較小小，可采用________________PCR技術(shù)擴擴增化學方法人工工合成從基因文庫獲獲取的方法二：基因表達達載體的構(gòu)建建——基因工工程的核心1目的：使目的基因在在受體細胞中中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代代，同時使目的的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因等啟動子：位于基因的首端的一段特殊的的DNA片斷斷，RNA聚合酶酶識別和結(jié)合的的部位終止子：位于基因的尾端的一段特殊的的DNA片斷斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄標記基因：鑒別受體細胞中是是否含有目的的基因，從而而將有目的基基因的細胞篩選出來3.基因表達達載體的構(gòu)建建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口四個黏性末端端DNA連接酶酶重組DNA分分子（重組質(zhì)質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端端跟蹤訓練(2012年江蘇無錫高高二檢測)如圖為基因表表達載體的模模式圖，下列列有關(guān)基因工工程中載體的的說法錯誤的的是()A．基因工程程的核心步驟驟是基因表達達載體構(gòu)建B．任何基因因表達載體的的構(gòu)建都是一一樣的，沒有差差別C．圖中啟動動子位于基因因的首端，是是RNA聚合酶酶識別和結(jié)合合的部位D．抗生素抗抗性基因的作作用是作為標標記基因，用于于鑒別受體細細胞中是否導入了目的的基因B三、將目的基基因?qū)胧荏w體細胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。2常用的受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。3目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞一般是體細胞受精卵一般原核細胞4、目的基因?qū)胧荏w細胞胞的方法為什么動物細細胞要用受精精卵做受體細細胞？全能性受限制制（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法法①農(nóng)桿菌特點點：易感染雙子葉植物和裸子植物物，對大大多數(shù)單子葉植物沒有有感染能力。。②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受受體細胞，并并整合到受體體細胞染色體體的DNA上上。三、目的基因因?qū)胧荏w細細胞構(gòu)建基因表達達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細胞導入穩(wěn)定維持和表表達③過程：（2）基因槍法：目的基因?qū)肴雴巫尤~植物物細胞①操作方法：：利用壓縮氣氣體產(chǎn)生的動動力，將包包裹在金屬粒粒表面的表達達載體DNA打入受體細細胞中，使目目的基因與其其整合并表達達的方法。②鎢粉粒子和金金粉粒子，粒粒子的直徑一一般在0.6～4um。。③適用：單子葉植物基因槍法（3）花粉管通道法法：將目的基因?qū)胫参锛毎俨僮鞣椒ǎ海涸谥参锘ㄊ苁芊酆?，花粉粉形成花粉管管還末愈合前前期，剪去柱柱頭，然后，，滴入DNA（含的基因因）使目的基基因借助花粉粉管通道進入入受體細胞②特點:十分簡簡便經(jīng)濟。③例：轉(zhuǎn)基因抗抗蟲棉（我國國）（4）、將目目的基因?qū)肴雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法目的基因表達達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新新性狀動動物（5）、將目目的基因?qū)肴胛⑸锛毎傥⑸镒魇荏w體細胞原因：：繁殖快、多為為單細胞、遺遺傳物質(zhì)相對對少②常用菌：大大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受受態(tài)細胞（改變細胞壁壁的通透性））④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞吸收DNA表達載體與感受態(tài)細胞混合從細胞器的功功能上分析，，若通過基因因工程生產(chǎn)人人的糖蛋白，，可以用大腸腸桿菌嗎？【提示】不可以，糖蛋蛋白上的糖鏈鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)和高爾基體體上加工完成成的，而內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)和高爾基基體存在于真真核細胞中，，大腸桿菌是是原核生物，，細胞中不含含有這兩種細細胞器。問題3導入過程完成成后，全部受受體細胞都能能攝入入重組DNA分子嗎？真正能攝入重重組DNA分分子的受體細細胞很少，且且有的會攝入入載體-載體體，目的基因因-目的基因因類型目的基因進入入受體細胞后后，是否都能能穩(wěn)定維持和和表達？不一定，需要要檢測問題4問題5練習采用基因工程程的方法培育育抗蟲棉，下下列導入目的的基因的做法法正確的是()①將毒素蛋白白注射到棉受受精卵中②將將編碼毒素蛋蛋白的DNA序列，注射射到棉受精卵卵中③將編碼碼毒素蛋白的的DNA序列列，與質(zhì)粒重重組，導人細細菌，用該細細菌感染棉的的體細胞，再再進行組織培培養(yǎng)④將編碼碼毒素蛋白的的DNA序列列，與細菌質(zhì)質(zhì)粒重組，注注射到棉的子子房并進入受受精卵A、①②B、②③C、③④D、①④C——檢查是否否成功分子水平個體水平：①檢測轉(zhuǎn)基因因生物染色體體的DNA上是否插入了了目的基因②檢測目的基基因是否轉(zhuǎn)錄錄出了mRNA③檢測目的基基因是否翻譯譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗抗病鑒定、活活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜雜交分子雜交抗原抗體雜交交四、目的基因因的檢測與鑒鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生物物染色體的的DNA上上是否插入入了目的基因基因探針：：放射性同位位素等標記記的含有目目的基因DNA片段段方法——DNA分子子雜交技術(shù)術(shù)變性變性變性方法——分子雜交技技術(shù)（2）檢測測目的