基因工程基本流程獲取目的基因

基因工程基本流程獲取目的基因第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日1獲取目的基因目的基因修飾、改良建立高效表達系統(tǒng)表達調(diào)控機制研究第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日2鳥槍法cDNA法PCR擴增化學合成基因文庫第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日3鳥槍法（shotgun

）用基因組中的隨機產(chǎn)生的片段作為模板進行克隆第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日4“鳥槍法”最初用于測定微生物基因組序列。近年來，美國塞萊拉公司利用改進的全基因組“鳥槍法”完成了果蠅和人類基因組的測序工作，證明了它在測定大基因組上的可行性和有效性。第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日5鳥槍法基本程序機械切割片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切

片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整1.目的基因組DNA片段的制備第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日6根據(jù)外源DNA片段的末端性質(zhì)、篩選方案和大小確定載體片段大小λ-噬菌體、YAC、BAC……篩選方案克隆載體：原位雜交或限制性酶切圖譜表達載體：基因產(chǎn)物功能檢測2.外源DNA片段的全克隆第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日7根據(jù)篩選方案確定受體：大腸桿菌：原位雜交或限制性酶切圖譜特異基因表達受體：基因產(chǎn)物功能檢測第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日8菌落原位雜交理想的探針是篩選的決定因素基因產(chǎn)物功能檢測依賴于篩選模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性限制性酶切圖譜

多次酶切篩選3.期望重組子的篩選第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日9限制性酶切圖譜第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日10例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將重組子用SalI切開，凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，回收DNA片段，根據(jù)目的基因內(nèi)部的特征性酶重復酶切過程直至篩選成功第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日11通過亞克隆在已克隆的片段上準確定位目的基因，然后對目的基因進行序列分析，搜尋其編碼序列以及可能存在的表達調(diào)控序列4.目的基因的定位第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日12鳥槍法操作的改進-非隨機鳥槍法前提條件：目的基因的酶切圖譜已知目的基因兩側的酶切位點已知兩個位點之間的距離已知如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日13鳥槍法的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識；不能獲得的最小長度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日14cDNA法

cDNAmRNA的互補DNA(complementaryDNA)反/逆轉(zhuǎn)錄病毒基因復制和表達中間產(chǎn)物分離mRNA體外合成cDNA克隆進入受體細胞篩選含有目的基因的重組克隆第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日151.mRNA的分離純化利用多數(shù)mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。含有poly(A)的mRNA親和層析低聚dT纖維素:用于poly(A)較長的mRNA多聚U瓊脂糖:用于poly(A)較短的mRNA（<20A）無poly(A)的mRNA第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日162.雙鏈cDNA的體外合成反轉(zhuǎn)錄酶1）cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，OligodT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日17cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’2）cDNA第二鏈合成-自身合成第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日18核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉?。?。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日19第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日202）cDNA第二鏈合成-置換合成RNaseH識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷DNAPolI除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日21mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日22第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日23第一鏈合成完畢后，變性去除殘留的mRNA，在cDNA的游離3’末端添加OligodC，然后與人工合成的OligodG退火，形成引物結構，聚合第二條鏈。3）cDNA第二鏈合成-引物合成第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日24mRNA3’5’AAAAAAAcDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’堿處理cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’dCTP末端轉(zhuǎn)移酶cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCC加入OligodG退火cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’AAAAAAA第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日25雙鏈cDNA的克隆克隆方案的選擇標準與鳥槍法相同末端性質(zhì)篩選方案片段大小第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日26cDNA重組克隆的篩選原位雜交產(chǎn)物功能檢測差示法（差別雜交/扣除雜交）第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日27在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達。在這種情況下便可制備到兩種不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA種的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。通過這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對由表達目的的基因的細胞總mRNA構建的克隆庫進行篩選。當使用存在目的基因的mRNA探針時，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點；而使用不存在目的基因的mRNA探針時，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點。比較這兩種底片并對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落。差別雜交第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日28第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日29局限性差別雜交的靈敏度比較低，特別是對于那些低豐度的mRNA而言，這個缺點就顯得更加突出差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗費時間和金錢

第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日30原理：羥基磷灰石柱結合DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）扣除雜交第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日31從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。將表達A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。第三十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日32AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BA第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日33PCR擴增法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必需的雙引物。TheNationalCenterforBiotechnologyInformation/NCBI

:EuropeanBioinformaticsInstitute/EMBL-EBI:DNADataBankofJapan/DDBJ:第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日341.直接從基因組中擴增（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設計引物（3）PCR擴增適合擴增原核生物基因。第三十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日35原核基因組部分原核細胞提取基因組DNAPCR擴增第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日36（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴增（3）根據(jù)目的基因序列設計引物2.從mRNA中擴增:RT-PCR適合擴增真核生物基因。第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日37目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的基因cDNA第二鏈PCRmRNA第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日38化學合成法1976年H.G.Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文?；瘜W合成目的基因的前提：核苷酸序列已知目前通用的合成方法：固相磷酸三酯合成法第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日39核苷酸1的3’-OH端在合成開始時就已經(jīng)附著在惰性的固相載體上，同時它的脫氧核糖環(huán)的5’-OH基團也已用二甲氧基三苯甲基(DMT)保護起來。這種固相載體典型的情況是使用可控微孔玻璃(CPG)。第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日40固相磷酸三酯合成過程結果是全保護的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對氯苯。最后脫保護。第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日合成的一個循環(huán)周期分為如下步驟：第一步，脫三苯甲基作用(detritylation)酸處理法，脫去與核苷酸1的5’-OH基團偶聯(lián)的保護基團DMT。在這種脫DMT反應中，常用的酸是二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)；第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日42第二步，偶聯(lián)反應(coupling)。通過一種弱堿——四唑(tetrazole)的催化反應，使加進來的第二個核苷酸(N2)同已附著在固相載體上的核苷酸1之暴露的5’-OH基縮合；第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日43第三步，封端反應(capping)。由加入的乙酸酐(aceticanhydride)激發(fā)乙酰化作用，把所有的沒有參與偶聯(lián)反應的5’-OH基團全都封閉起來；第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日44第四步，氧化作用(oxidation)。在核苷酸N1和N2之間新形成的3’-5’亞磷酸三酯鍵十分活躍。利用碘液催化作用，使之被氧化成為相當穩(wěn)定的3’-5’磷酸三酯鍵。這也就是為何我們稱這種寡核苷酸合成法為磷酸三酯法的原因。第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日45化學合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而絕大多基因的大小超過了這個范圍，因此，需要將寡核苷酸適當連接組裝成完整的基因第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日46小片段黏接法預先設計合成12-15bp的片斷，片段之間都有互補區(qū)域，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。因此DNA片段在退火時可以自動排序，最后用T4連接酶連接即可得到完整基因?；瘜W合成DNA片斷的組裝第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日47T4DNA連接酶完整的DNA雙鏈退火第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日48優(yōu)點：DNA片段小，回收效率高缺點：互補序列短，退火時容易錯配第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日49補丁延長法目的基因的一條鏈分成若干40-50bp的片段，另一條鏈設計成與上述大片段交錯互補的小片段（約20bp）DNA片段在退火用Klenow將空缺處補齊，最后用T4連接酶修復缺口。第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日50退火KlenowT4DNA連接酶第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日51大片段酶促法預先設計的片斷之間有局部互補區(qū)，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日523’5’5’3’5’3’T4DNA連接酶Klenow片段引物第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日53將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為:基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary,含有全部基因）cDNA文庫（complementaryDNAlibrary,含有全部蛋白質(zhì)編碼的結構基因）基因文庫第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日54

基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數(shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）基因文庫的完整性第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日55例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日56cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）N=ln(1-p)ln(1-)1n1n第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日57例如：人的成纖維細胞中，每個細胞內(nèi)不到14個拷貝的低豐度mRNA約占整個mRNA含量的30%，這種mRNA大約11000種，因此1nn=11000/30%=37000=1/37000N=ln(1-0.99)ln(1-)137000=1.7×105包含完整人成纖維細胞cDNA信息的文庫需要17萬個克隆第五十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日58

文庫的質(zhì)量標準1.重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力2.載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆3.克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序4.克隆片段易于從載體分子上完整卸下5.重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選第五十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日59制備原則：DNA片段之間存在部分重疊、大小均一（1）染色體DNA大片段的制備超聲波機械攪拌①物理切割法-平末端內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30