靈芝孢子對體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響,藥學(xué)論文

靈芝孢子對體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響,藥學(xué)論文卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其治療以手術(shù)和化療為主。隨著治療手段的提高，患者的生存率和生活質(zhì)量也得到了一定程度的提高，但由于治療效果仍不特別理想，其病死率仍居婦科惡性腫瘤之首。因而尋求有效的治療方式方法仍然是卵巢癌的研究焦點。當(dāng)前中藥作為卵巢癌輔助治療手段之一越來越遭到重視。靈芝孢子在我們國家及其他亞洲國家已被公以為治療多種疾病的中藥，并且已有大量應(yīng)用靈芝孢子治療各種腫瘤的研究報道［1－3］。本研究觀察了在不同藥物濃度下靈芝孢子對體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響，討論其對人卵巢癌OV2008細(xì)胞生長抑制作用的機(jī)制，為其在卵巢癌的臨床應(yīng)用提供理論根據(jù)。1材料與方式方法1．1材料1．1．1儀器:NU2600E型CO2培養(yǎng)箱(ESBEScientif-icMC017A1C);超凈工作臺(MicrozonecoinporationF40BX/SPZ41);EL340酶標(biāo)儀(Bio．TEKINSTＲU-MENTSINS);倒置相差電子顯微鏡(ZEISSAXIOVEＲT25);熒光顯微鏡(NIKONTE2000-U);水浴箱(FisherScientificISOTEMP210);離心機(jī)(SheltonScientificCENTＲACL2);流式細(xì)胞儀(BDFACScali-ber:BDBIOsciencesE97600092)。1．1．2試劑與藥品:靈芝孢子粉由加拿大energene天然藥品有限公司提供，批號為083668。WST-1/ECS溶液為Ｒoche公司產(chǎn)品;ＲPMI1640培養(yǎng)基為FisherScientific公司產(chǎn)品、新生小牛血清、Hoechst33258為Invitrogen公司產(chǎn)品;青鏈霉素(含10000U青霉素及10000微克鏈霉素)為Invitrogen公司產(chǎn)品，批號為15140-148。臺盼蘭(Trypanblue)EMD公司產(chǎn)品，批號EM8721-0;Trypsin、碘化丙啶(PI)、核糖核酸酶A(ＲnaseA)多聚甲醛溶液(Paraformaldehyde)、為Sigma公司產(chǎn)品;Bax、bcl-2、cleaved-casepase3抗體為cellsig-nalingTechnology公司產(chǎn)品;p27Kip1抗體為BDBio-science產(chǎn)品?？故蠹翱雇枚官徲贔isherScientific公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及感光膠片為GE公司產(chǎn)品。1．2方式方法1．2．1細(xì)胞來源及培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞系OV2008為完成該實驗的加拿大york大學(xué)生命科學(xué)系chunpeng實驗室保存。用含10%胎牛血清(Sigma公司產(chǎn)品)、1%青霉素鏈霉素(Invitrogen公司產(chǎn)品)的ＲPMI1640培養(yǎng)基(Thermo公司產(chǎn)品)，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1．2．2靈芝孢子粉工作液配制:靈芝孢子粉由加拿大energene天然藥品有限公司提供。將靈芝孢子粉500mg溶于10mlDD-H2O中配制成50mg/ml的靈芝孢子液，高溫滅菌、促溶，靜置或離心后取上清，用0．20m微孔濾膜過濾器過濾除菌，即刻用于實驗或作為儲存液密封置于4℃冰箱，保存2周，再次使用前70℃孵育10min。1．2．3WST-1法檢測靈芝孢子粉對人卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用:取對數(shù)生長期的OV2008細(xì)胞，0．2%Trypsin消化后，以每孔4000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后試驗組分別參加濃度為0．1、0．5、1、2、2．5mg/ml的靈芝孢子液，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，對照組5個孔同時更換培養(yǎng)液，分別于24、48h進(jìn)行比色檢測細(xì)胞活力。根據(jù)試劑盒講明書于每一時間點每孔中參加10lWST-1/ECS溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min，充分振蕩1min，酶標(biāo)儀測定波長為450nmOD值，計算藥物對細(xì)胞生長的抑制率，細(xì)胞抑制率=1－試驗組平均OD值/對照組平均OD值100%。IC50用Logit法計算。1．2．4細(xì)胞計數(shù)法檢測靈芝孢子對人卵巢癌細(xì)胞生長抑制作用:OV20008細(xì)胞消化后以每孔10104個細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后試驗組分別參加濃度為0．1、0．5、1、2mg/ml的靈芝孢子液，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，對照組3個孔參加不含藥物的培養(yǎng)液。48h顯微鏡下拍照各組細(xì)胞形態(tài)，之后收獲細(xì)胞，消化細(xì)胞后以1∶1比例與臺盼蘭混合，光學(xué)顯微鏡下死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，而存活細(xì)胞因有完好細(xì)胞膜存在不被染色，鏡下用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)未染色的活細(xì)胞數(shù)目。1．2．5流式細(xì)胞技術(shù)測定卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布:取對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞系OV2008，消化后接種100104個細(xì)胞于6cm細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后實驗組吸去原培養(yǎng)液，分別置入終濃度為0．5、1、2mg/ml的靈芝孢子粉溶液，對照組參加不含藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48和72h，收集細(xì)胞。0．2%Trypsin消化后離心，棄去上清液，1PBS5ml洗滌后以70%冷乙醇固定，冰上放置30min后直接上機(jī)測定或保存于－20℃冰箱待測。上機(jī)前離心棄去冰乙醇，PBS洗2次后以預(yù)染溶液(0．2%Triton-100、1mmol/LEDTA)洗滌一次，加50g/ml核糖核酸酶A(ＲnaseA)及50g/ml碘化丙啶(PI)，避光染色60min，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾后，用流式細(xì)胞儀測定，計算出細(xì)胞周期分布情況。1．2．6Hoechst-33258染色方式方法評估細(xì)胞凋亡:采用Hoechst-33258染色方式方法評估細(xì)胞凋亡，接種50104個細(xì)胞于6cm細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后，以不同濃度靈芝孢子處理細(xì)胞，48h后對照組和實驗組細(xì)胞分別吸掉培養(yǎng)液，以4%的多聚甲醛溶液(用1PBS配制)固定細(xì)胞20min，1PBS洗滌后以1g/ml的Ho-echst-33258染色15min，1PBS洗滌2次，熒光顯微鏡(NIKONECLIPSETE2000-U)下通過紫外光觀察細(xì)胞核的改變。1．2．7Westernblot方式方法測定bcl-2和Bax，cleaved-caspase3，P27蛋白表示出:人卵巢癌細(xì)胞OV2008以每孔25104個細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，次日參加相應(yīng)劑量的靈芝孢子粉溶液，對照組同時更換培養(yǎng)液，48h提取總蛋白。細(xì)胞用冷PBS洗滌2次，用50lＲapa裂解液(radioimmuneprecipitationassaybuffer)裂解細(xì)胞，冰上30min后刮取細(xì)胞，以12000r/min4℃離心15min，收集上清移入新的1．5ml離心管中，測定蛋白濃度。取20g(cleavedcasepase-3取50g)蛋白樣品經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠(檢測cleavedcase-pase-3用15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠)90V電壓進(jìn)行電泳分離，之后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜(Millipore公司產(chǎn)品)上，用含有50g/L去脂奶粉的TBST(10mmol/LTris-Cl(pH值8．0)，150mmol/LNaCl，0．05%Tween20)封閉1h，分別參加抗bcl-2(1∶1000)，bax(1∶4000)，cleaved-caspase-3(1∶500)，P27(1∶1000)的抗體(cellsignalingTechnology公司產(chǎn)品)4℃反響過夜，T-BST漂洗3次，每次10min。HＲP標(biāo)記的抗兔IgG二抗孵育1h;T-BST漂洗3次，應(yīng)用ECL-plusWesternBlot化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色檢測信號。以-actin為內(nèi)參照。1．3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用Sigmastat3．5統(tǒng)計軟件，計量資料以x表示，采用t檢驗，兩組以上均數(shù)比擬應(yīng)用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2．1靈芝孢子抑制卵巢癌細(xì)胞增殖WST-1比色法顯示，靈芝孢子對卵巢癌OV2008細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，柱狀圖顯示活性細(xì)胞較對照組明顯減少，靈芝孢子作用48h的IC50為(1．300．56)mg/ml。采用不同濃度的靈芝孢子處理接種于12孔培養(yǎng)板的OV2008細(xì)胞48h，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞數(shù)目隨濃度增加而減少，高濃度靈芝孢子組可見細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿壁成懸浮狀態(tài)，致貼壁存活細(xì)胞數(shù)目極少(圖2A)。圖2B為細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，提示隨靈芝孢子濃度增加存活細(xì)胞數(shù)目逐步減少。見圖1、2。2．2靈芝孢子對卵巢癌細(xì)胞周期分布的影響本研究應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測靈芝孢子作用于卵巢癌細(xì)胞后細(xì)胞周期的分布，靈芝孢子處理OV2008細(xì)胞后多數(shù)細(xì)胞聚集于G1期，并且G1期細(xì)胞數(shù)目隨作用時間延長而增加。而S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)目較少，且G2/M細(xì)胞隨作用時間延長而減少，S期細(xì)胞數(shù)目隨作用時間無明顯改變。見圖3。2．3靈芝孢子誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡為明確靈芝孢子能否通過凋亡途徑致卵巢癌細(xì)胞死亡，采用Hoechst-33258染色方式方法檢測卵巢癌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示靈芝孢子可致卵巢癌細(xì)胞凋亡，并呈劑量依靠性。熒光顯微鏡觀察到典型凋亡細(xì)胞染色后表現(xiàn)為細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)濃縮，藥物濃度越大凋亡細(xì)胞越多。見圖4。4靈芝孢子對卵巢癌細(xì)胞相關(guān)蛋白的表示出靈芝孢子對bcl-2和Bax蛋白表示出的影響:為明確靈芝孢子引起卵巢癌細(xì)胞凋亡的信號通道，利用靈芝孢子處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)測定了bcl-2和Bax的表示出情況。結(jié)果表示清楚隨靈芝孢子濃度增加bcl-2蛋白表示出水平降低，而bax蛋白水平升高靈芝孢子對P27蛋白表示出的影響:為了說明靈芝孢子對卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞周期影響的機(jī)制，采用westernblot方式方法測定了P27的變化。結(jié)果顯示P27蛋白水平隨靈芝孢子濃度增加而增加。靈芝孢子對Casbase-3蛋白表示出的影響:為了評估Casbase-3在靈芝孢子引起卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用，檢測了Casbase-3蛋白在卵巢癌細(xì)胞的表示出情況。Westernblot結(jié)果顯示35KD的Casbase-3被激活成活化的19、20kD的cleaved-casepase3，并隨靈芝孢子濃度增加表示出呈升高趨勢。見圖5。3討論靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的象淡霧狀的極其微小的孢子，其主要成分有靈芝多糖、三萜類化合物、生物堿類、多肽及微量元素鋅、鍺、硒等，有其發(fā)揮強大生理功能的重要分子學(xué)基礎(chǔ)。體內(nèi)外研究表示清楚靈芝孢子能夠抑制多種腫瘤的生長［4－6］。并有實驗表示清楚靈芝破壁孢子較完好孢子有更高層次的生物活性［7］。因而本研究采用破壁的靈芝孢子作為處理因素，用不同濃度的破壁靈芝孢子處理卵巢癌細(xì)胞株OV2008不同時間，觀察到靈芝孢子能夠抑制卵巢癌細(xì)胞生長，使細(xì)胞生長阻滯于G1期;并能通過上調(diào)Bax，caspase-3及下調(diào)bcl-2蛋白途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。卵巢癌細(xì)胞OV2008參加不同濃度的靈芝孢子作用48h能夠觀察到細(xì)胞生長遭到抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿呈漂浮狀態(tài)，這種抑制作用呈劑量依靠性，靈芝孢子濃度的增加，對細(xì)胞的增殖抑制作用加強，半數(shù)抑制濃度為1．0977mg/ml。通過DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst33258染色觀察到靈芝孢子作用于卵巢癌細(xì)胞后出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞染色質(zhì)聚集改變。提示靈芝孢子能夠通過周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡途徑發(fā)揮增殖抑制作用。靈芝孢子對腫瘤細(xì)胞周期的影響有不同的報道，Zhu等［2］的研究表示清楚靈芝孢子的酒精提取物能夠使宮頸癌HeLa細(xì)胞停滯于G1/S期，Hu等［8］在乳腺癌MCF-7細(xì)胞的研究得到同樣的結(jié)果。靈芝孢子的水提取物作用于hepatoma細(xì)胞能夠引起細(xì)胞G2/M期捕獲［9］。不同的結(jié)果可能由于不同的提取方式方法造成提取物成分有所差異所致［10］。本研究結(jié)果提示靈芝孢子作用于OV2008細(xì)胞48h后，可使細(xì)胞周期的分布發(fā)生明顯變化，使停滯于G1期的細(xì)胞比例明顯增加并隨靈芝孢子作用時間而逐步增加。表示清楚靈芝孢子對OV2008細(xì)胞的增殖抑制作用可能與多數(shù)腫瘤細(xì)胞停滯于G1期，減少了DNA合成和有絲分裂有關(guān)。P27屬于CKIs類蛋白，能廣泛抑制cyclinD/CDK復(fù)合物的活性，使細(xì)胞發(fā)生G1～S期阻滯，進(jìn)而對細(xì)胞周期發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［11，12］。本研究結(jié)果顯示靈芝孢子處理OV2008細(xì)胞后P27蛋白表示出水平隨靈芝孢子濃度增加而逐步升高，與細(xì)胞周期的變化相一致。揣測靈芝孢子通過P27調(diào)控細(xì)胞周期。抑制腫瘤的重要途徑之一是誘導(dǎo)凋亡，bcl-2家族中的bcl-2和Bax是調(diào)控凋亡的重要基因，細(xì)胞中bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，而bax能夠促進(jìn)凋亡［13］，它能夠與本身或bcl-2構(gòu)成二聚體，進(jìn)而抑制bcl-2活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生［14］。P27能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。本研究中卵巢癌細(xì)胞經(jīng)靈芝孢子處理后Bax、P27蛋白表示出水平升高而bcl-2、bcl-xl表示出水平下降，可能是引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。Casepase家族是凋亡經(jīng)過中的效應(yīng)蛋白，活化的casepase-3能通過蛋白酶的水解進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。華而不實casepase-3是casepase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，廣泛分布于各種類型的細(xì)胞中。Casepase-3在細(xì)胞中是以無活性的酶原(32kD)形式存在，活化的Casepase-3(17kD和19kD)能促進(jìn)凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表示清楚，細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵是凋亡下游蛋白casepase-3的激活，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。靈芝孢子處理OV2008細(xì)胞48h可產(chǎn)生活化的Ca