多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段新

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段新第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日DNA指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過案發(fā)現(xiàn)場的血液、頭發(fā)等樣品中提取的DNA，與犯罪嫌疑人的DNA進(jìn)行比較，就由可能為案件的偵破提供證據(jù)。討論：1.犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的DNA呢？2.你還能說出DNA鑒定技術(shù)在其他方面的應(yīng)用嗎？第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日★分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程美國科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng)

第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一、基礎(chǔ)知識(shí)脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCTDNA的基本單位－脫氧核苷酸12345O第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸脫氧核苷酸的種類A腺嘌呤脫氧核苷酸GCT第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“－OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’，5’-磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端DNA分子的平面結(jié)構(gòu)第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端

識(shí)別：-OH端為3′;磷酸基團(tuán)的末端為5′。第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴.DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵.

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶.兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對，

一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日（1）DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。4.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（2）

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。（3）兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤（A）一定與

配對，鳥嘌呤（G）一定同

配對。兩條反向平行雙螺旋脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日2、時(shí)間：細(xì)胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）1、概念：以親代DNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對合成子代在DNA的過程。3、場所：主要是細(xì)胞核（其次是線粒體、葉綠體）二．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過程第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日4、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈②原料：游離的四種脫氧核苷酸③能量：ATP④

酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對5、過程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的兩條母鏈為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對規(guī)則，合成子鏈。（3）子鏈、母鏈螺旋構(gòu)成子代DNA第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日6、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。7、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日8.遵循原則：堿基互補(bǔ)配對原則9.精確復(fù)制的原因a.規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板b.堿基互補(bǔ)配對保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行10.復(fù)制的意義:DNA分子通過復(fù)制將遺傳信息從親代傳給了后代，保持了遺傳信息的連續(xù)性。第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸,通常是一小段RNA第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈的原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸

思考：體外擴(kuò)增DNA時(shí)，如何提供與體內(nèi)DNA復(fù)制相似條件？

變性（80～100℃

）TaqDNA聚合酶（耐高溫）20～30個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNA第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子鏈能量ATP不需要引物一般是一小段DNA或RNA,20-30個(gè)核苷酸使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（一）、PCR的技術(shù)（DNA體外復(fù)制）的條件二、PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日（二）PCR原理DNA雙鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）DNA單鏈變性的目的：解開雙鏈復(fù)性的目的：有利于引物1和引物2與兩條單鏈的結(jié)合第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日PCR擴(kuò)增儀PCR擴(kuò)增儀實(shí)際上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變性原理，通過自動(dòng)改變溫度，達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1～3步30輪DNA復(fù)制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸變性→復(fù)性（退火）

→

延伸（三）PCR的反應(yīng)過程：第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日二、PCR的反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬（220）倍以上。第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)過程總結(jié)第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日三、PCR實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL3、微量移液器

用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上是能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日4、離心機(jī)一種通過高速轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的設(shè)備。第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步驟：第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA含量的測定：稀釋→對照調(diào)零→測定→計(jì)算50倍蒸餾水做對照波長260nm處讀數(shù)第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評(píng)價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測定1、原理

可以通過測量DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日光吸收波長／nm2602402202800.10.2第三十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日2、過程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計(jì)算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)第三十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA

的含量為50g/mL紫外分光光度計(jì)比色杯第三十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸第三十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計(jì)算第三十七頁，共三十九頁，202