降低粒徑對雄黃的抑瘤活性提升作用分析,藥學(xué)論文

降低粒徑對雄黃的抑瘤活性提升作用分析,藥學(xué)論文雄黃在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，最早記載見于(神農(nóng)本草經(jīng)〕，具有解毒、殺蟲、燥濕、祛痰、截瘧的成效。(中國藥典〕記載：雄黃，辛溫有毒，入肝胃經(jīng)；具有解毒殺蟲、化痰消積、燥濕祛風(fēng)的成效，內(nèi)服每次０．５～２．０ｇ，外用適量［１］。２０世紀(jì)８０年代，有人以含雄黃的方劑治療慢性粒細胞白血病，獲得一定療效［２］，但雄黃毒副作用較大，臨床應(yīng)用遭到限制。２０世紀(jì)９０年代，砷制劑在腫瘤中的療效重新引起人們的注意，尋找高效低毒的砷制劑成為腫瘤研究的一個方向。本研究制備了３種粒徑的雄黃，對其進行了粒度和外型的觀察，并通過細胞培養(yǎng)和體內(nèi)移植腫瘤的方式方法，研究雄黃體內(nèi)外的抑瘤作用，討論降低粒徑對雄黃的抑瘤活性能否有提高作用。１材料與方式方法１．１瘤種與實驗動物肝癌細胞株ＳＭＭＣ７７２１由南京八一醫(yī)院肝癌研究所提供，Ｈｅｐ腫瘤腹水小鼠購自南京市腫瘤醫(yī)院。雄性ＩＣＲ小鼠６０只，體質(zhì)量〔２０２〕ｇ，等級ＳＰＦ，供貨北京維通利華實驗動物有限公司。合格證號：ＳＣＸＫＳ〔京〕２０１２－０００１。南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心許可證號：ＳＹＸＫ〔蘇〕２０１２－００４２。１．２藥物與試劑雄黃購于江蘇省藥材公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為硫化物類礦物藥雄黃族雄黃〔Ｒｅａｌｇａｒ〕。亞砷酸注射液〔Ａｓ２Ｏ３〕為哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：２０１２０８０１，濃度為１ｇ／Ｌ，使用時稀釋１０倍。ＲＰＭＩ１６４０培養(yǎng)液和０．２５％胰蛋白酶購自美國ＭＥＲＣＫ公司，四甲基氮唑鹽〔ＭＴＴ〕購自瑞士ＦＬＵＫＡ公司，二甲基亞砜〔ＤＭＳＯ〕購自美國ＭＥＲ－ＣＫ公司。１．３儀器設(shè)備ＺＨＷＹ－１型氣流粉碎機購自江陰市宏達粉體設(shè)備有限公司，Ｍ－１１０ＥＨ型微射流制粒機購自上海鯉躍精致細密機械貿(mào)易有限公司，ＭＡＬＶＥＲＮＭＡＳＴＥＲＳＩ－ＺＥＲ激光粒度測試儀購自英國ＭＡＬＶＥＲＮ公司，ＮＡＰＣＯ６５００培養(yǎng)箱購自美國ＮＡＰＣＯ公司，ＩＸ５１Ｏ－ｌｙｍｐｕｓ倒置顯微鏡和ＳＺＸ７體視鏡購自日本Ｏｌｙｍ－ｐｕｓ公司，ＤＧ３０２２Ａ型酶聯(lián)免疫檢測儀購自南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，北航Ｃｍｉａｓ９８Ａ圖象分析系統(tǒng)購自北京航空航天大學(xué)，Ｘ－６５０掃描電子顯微鏡購自日立公司，Ｄ／ＭＡＸ－ｒＡＸ射線衍射儀購自日本理學(xué)制作所。１．４方式方法１．４．１雄黃藥品的制備１〕水飛雄黃〔Ⅰ〕：按藥典方式方法制備。２〕氣流粉碎雄黃〔Ⅱ〕：以ＺＨＷＹ－１型氣流粉碎機制備，氣壓為１．０ＭＰａ，進樣速度約０．２ｍＬ／ｓ。３〕微射流雄黃〔Ⅲ〕：以Ｍ－１１０ＥＨ型微射流制粒機制備，２５０００ｐｓｉ，１０ｐａｓｓ，最后１次５０００ｐｓｉ，得到微射流雄黃樣品。１．４．２粒徑測定雄黃以水混旋，超聲分散，ＭＡＬＶ－ＥＲＮＭＡＳＴＥＲＳＩＺＥＲ激光粒度測試儀測定粒徑。１．４．３雄黃顆粒的電子顯微鏡測定條件加速電壓２０ｋＶ，噴金，純鋁樣品托。１．４．４雄黃顆粒的Ｘ射線衍射測定Ｃｕ靶，管壓４０ｋＶ，管流１５０ｍＡ，掃描角度１０～８０，掃描速度１０／ｍｉｎ，狹縫系統(tǒng)１、１、０．３和０．３。１．４．５細胞形態(tài)觀察ＲＰＭＩ１６４０完全培養(yǎng)液培養(yǎng)ＳＭＭＣ７７２１細胞，參加濃度為２２．５ｍｇ／Ｌ的不同粒徑的雄黃，２４ｈ后觀察細胞生長狀況。１．４．６細胞增殖力測定將１００Ｌ〔１～５〕１０５ｍＬ－１ＳＭＭＣ７７２１細胞植入９６孔培養(yǎng)板內(nèi)〔１００Ｌ／孔〕，待細胞貼壁后參加不同粒徑的藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ１０Ｌ，使得雄黃終濃度為２２．５ｍｇ／Ｌ，重復(fù)１０孔。培養(yǎng)１２ｈ后ＭＴＴ法測定４９０ｎｍ處的吸光度〔Ａ〕值。增殖抑制率〔％〕＝陰性對照組Ａ值－用藥組Ａ值╱陰性對照組Ａ值１．４．７對動物接種移植瘤的抑瘤作用無菌條件下抽出腫瘤小鼠的腹水，１∶４生理鹽水稀釋。分別給６０只雄性ＩＣＲ小鼠右前肢腋下接種０．２ｍＬ稀釋后的腹水液，３ｄ后１５只一組隨機分為４組。華而不實３組每日分別以３種粒徑的雄黃灌胃０．３ｍＬ〔２．２５ｇ／ｋｇ〕，另１組每日灌以生理鹽水０．３ｍＬ作為對照。連續(xù)灌胃１０ｄ，最后一次灌胃后２４ｈ處死，剝?nèi)×鰤K，稱質(zhì)量后以ＨＥ染色法染色，光鏡下觀察，圖像分析儀統(tǒng)計分析。１．５統(tǒng)計學(xué)方式方法采用ＳＰＳＳ１５．０進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用ｘ－ｓ表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，多組間均數(shù)比擬用單因素方差分析，多組間兩兩比擬采用ＬＳＤ法。檢驗水準(zhǔn)＝０．０５。２結(jié)果２．１粒徑與粒度分布在累積百分率曲線上占顆?？偭繛椋保埃ァⅲ担埃ズ停梗埃ニ鶎?yīng)的粒子直徑表示為ｄ１０、ｄ５０和ｄ９０，粒度分布用分布寬度〔ＳＰＡＮ〕表示。ＳＰＡＮ＝〔ｄ９０－ｄ１０〕／ｄ５０。３種雄黃顆粒的粒度和粒度分布數(shù)據(jù)見表１。２．２電子顯微鏡測定結(jié)果如此圖１所示，水飛樣品外表粗糙，有較多的尖銳角，但分散度較好；氣流粉碎十分是微射流的樣品粒度小，均勻性好，外表圓滑，顆粒的球性度提高。２．３Ｘ射線衍射測定從Ｘ射線衍射圖譜能夠看出，微射流雄黃樣品的衍射峰寬明顯加大，講明其晶體粒度減小〔圖２〕。根據(jù)公式＝／〔ＣＯＳ〕，計算３個樣品的平均晶粒度分別為３８．２９、２６．８８和１４．６５ｎｍ，講明超細化不僅能減小雄黃的顆粒度，而且對其晶粒度也有影響，使其呈現(xiàn)降低的趨勢。２．４腫瘤細胞形態(tài)參加雄黃前后ＳＭＭＣ７７２１細胞的形態(tài)見圖３。細胞與雄黃一起培養(yǎng)后，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。十分是微射流組的腫瘤細胞，更早、更明顯地出現(xiàn)凋亡特征。２．５ＭＴＴ測定結(jié)果水飛組、氣流組、微射流組和對照組經(jīng)正態(tài)性檢驗，均服從正態(tài)分布〔Ｐ＞０．０５〕，經(jīng)Ｌｅｖｅｎｅｔｅｓｔ也知足方差齊條件〔Ｐ＞０．０５〕，因而采用方差分析。分析結(jié)果表明，多組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Ｆ＝４３０．９００，Ｐ＜０．００１。水飛組、氣流組、微射流組和對照組Ａ值分別為０．４０２０．０３６、０．２７８０．０２４、０．１８３０．０２１和０．６３４０．０３６，與對照組比擬Ａ值均顯著降低〔Ｐ＜０．００１〕，講明雄黃對ＳＭＭＣ７７２１肝癌細胞的生長有抑制作用。水飛組、氣流組和微射流組增殖抑制率分別為３６．６％、５６．２％和７１．１％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔Ｐ＜０．００１〕，講明隨著粒度的降低，雄黃對ＳＭＭＣ７７２１肝癌細胞的抑制作用加強。２．６在體抑瘤效果對照組、水飛組、氣流組和微射流組小鼠的瘤塊質(zhì)量分別為〔０．６３４７０．２０８５〕、〔０．４２５８０．２３０８〕、〔０．３４８２０．１５３１〕和〔０．３０７７０．１１６８〕ｇ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Ｆ＝３．７６，Ｐ＝０．０２８；４組小鼠的瘤塊壞死率分別為〔１８．０６．５〕％、〔２５．５１９．８〕％、〔３２．７１２．４〕％和〔３７．２１１．８〕％，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義，Ｆ＝２．９４，Ｐ＝０．０４１。講明與對照組相比，雄黃可降低小鼠腫瘤的質(zhì)量和壞死面積，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。３討論雄黃在抗腫瘤方面的作用逐步引起人們的關(guān)注，但由于其不易溶于水，所以很難被人體吸收，生物利用度低，且臨床用藥量大，患者依從性差。有研究顯示，口服過量雄黃精粉引起人急性砷化物中毒［３］。除此之外，有研究證實雄黃能致體內(nèi)外細胞染色體畸變，具有遺傳毒性［４］。孕兔服用雄黃后表現(xiàn)出明顯臨床毒性反響，活胎率下降，晚期胚胎流失率上升，具生殖毒性［５］，長期服用，還可產(chǎn)生蓄積毒性。這些毒副作用極大地限制了雄黃在臨床上的進一步應(yīng)用。隨著納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的飛速發(fā)展，納米藥物以新奇、顯著、獨特的療效在醫(yī)藥行業(yè)中獲得廣泛應(yīng)用，納米雄黃也以其高生物利用度和低毒副作用備受關(guān)注［６］。采用物理或化學(xué)方式方法制備納米雄黃，可提高雄黃的溶解度和生物利用度，降低其毒副作用［７］。有研究表示清楚，不同粒徑的雄黃體外抑菌效果與粉體粒徑大小呈負相關(guān)［８］，且誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡及毒副作用上具有尺寸效應(yīng)，即納米顆粒越小，作用效果越強［９］。近年來，納米雄黃抗腫瘤的體外研究比擬廣泛。齊元富等［１０］發(fā)現(xiàn)納米雄黃可抑制人皮膚鱗狀細胞癌Ａ４３１細胞株增殖和新生血管的生成，且隨劑量增加效果加強。其機制可能與納米雄黃上調(diào)色素上皮源性因子的表示出和下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表示出有關(guān)［１１］。納米雄黃對宮頸癌細胞株增殖有抑制作用，且能誘導(dǎo)其凋亡［１２－１３］。除此之外，還有研究發(fā)現(xiàn)納米雄黃可誘導(dǎo)耐藥性白血病細胞和肺癌Ａ５４９細胞凋亡［１４－１５］，并能顯著誘導(dǎo)白血病干細胞發(fā)生凋亡［１６－１７］，這對說明雄黃抗腫瘤的機制有很大的指導(dǎo)作用。固然納米雄黃抑制腫瘤的研究已有很多報道，但基本局限于體外細胞實驗，體內(nèi)抗瘤研究少見。因而，本研究在體外研究的基礎(chǔ)上，對納米雄黃體內(nèi)抑瘤效應(yīng)進行了比較。本實驗發(fā)現(xiàn)，雄黃作用于肝癌ＳＭＭＣ７７２１細胞后，細胞出現(xiàn)了凋亡形態(tài)，細胞體積縮小，胞質(zhì)固縮。隨著粒度的降低，凋亡小體數(shù)量增加，雄黃顆粒越小，對ＳＭＭＣ７７２１細胞的抑制作用越強。除此之外，雄黃還能抑制ＩＣＲ小鼠的移植瘤生長，同時也呈現(xiàn)出粒度效應(yīng)。本研究結(jié)果講明，提高雄黃的制粒水平，降低雄黃粒徑，在保證抗腫瘤療效的前提下能夠通過降低雄黃制劑的粒徑來到達降低雄黃毒性的效果，尤其有意義的是，小鼠的在體移植瘤實驗結(jié)果也充分證明了這一點。值得注意的是，在制備納米化雄黃的經(jīng)過中，納米微粒極易聚合為大顆粒而減弱雄黃的作用，由于雄黃到達納米級后極易發(fā)生團圓，不易使用，且外表積增加，容易氧化成Ａｓ２Ｏ３導(dǎo)致毒性增加。為解決這一問題，本研究在制備微射流雄黃的經(jīng)過中參加了分散劑以降低顆粒的聚合作用。有研究者通過固體分散體技術(shù)來增加納米雄黃的穩(wěn)定性，不僅使納米微粒的聚合作用下降，還提高了雄黃的抗氧化性，毒性也得到降低［１８］。這一技術(shù)有望在雄黃納米化的應(yīng)用中得到進一步的提高。以下為參考文獻［１］國家藥典委員會．中國藥典２０１０年版一部［Ｓ］