Lipofect脂質體轉染試劑

Lipofect脂質體轉染試劑簡介：夕卜源基因導入真核細胞的方法有很多種，如磷酸鈣轉染法、DEAE-葡聚糖轉染法、脂質體法、電穿孔法、顯微注射法等。LeageneLipofect脂質體轉染試劑（LipofectTransfectionReagent是一種新型的陽離子脂質體轉染試劑，適用于把質粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸以及核酸蛋白復合物或帶負電荷的蛋白轉染到真核細胞中。LeageneLipofect脂質體轉染試劑對于常見的哺乳動物細胞具有較高的轉染效率，較好的重復性，且操作簡以及單細胞毒性較小，可用于貼壁細胞和懸浮細胞。Lipofect脂質體轉染試劑使用方法與Lipofectamine?2000Reagent極為相似。該轉染試劑轉染細胞時，基本不受細胞培養(yǎng)液中的血清和抗生素的影響，即可以在血清和抗生素存在的情況下進行細胞轉染。但為了取得最佳的轉染效果，推薦轉染時使用不含抗生素的含血清的細胞培養(yǎng)液。組成：名稱編號CZ0002CZ0002CZ0002StorageLipofect脂質體轉染試劑0.5ml1ml5x1ml4°C使用說明書1份自備料：1、 胰蛋白酶消化液2、 完全培養(yǎng)液和不完全培養(yǎng)液3、 PBS操作步驟（僅供參考）:（-）DNA轉染：1、 （以12孔板為例）在轉染前18~24h用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，取適量對數(shù)期細胞轉移至12孔板中，并將細胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞密度達到即可進行轉染。后續(xù)操作步驟均按12孔板計算，如果轉染器皿不同，請按比例自行調節(jié)用量。2、 在加入待轉染的DNA之前2~4h,加入不含抗生素的完全培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養(yǎng)液，但抗生素使某些細胞轉染后出現(xiàn)一定的細胞毒性。3、 配制轉染工作液：取兩個無菌離心管，分別加入不含抗生素和血清的培養(yǎng)液，取其中一

離心管加入DNA，輕輕混勻；取另一離心管加入Lipofect脂質體轉染試劑，輕輕混勻。室溫靜置，將含有DNA的培養(yǎng)液用微量移液器輕輕加入含Lipofect脂質體轉染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置。4將上述轉染工作液逐滴滴入對應細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。5、 培養(yǎng)后，更換為含有血清的完全培養(yǎng)液。對于Hela細胞，推薦在轉染4h更換培養(yǎng)液;

對于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT細胞，推薦在轉染6h更換培養(yǎng)液。6、 繼續(xù)培養(yǎng)24~48h后，觀察或收集細胞或加入適當?shù)暮Y選藥物如G418等進行穩(wěn)定細胞株的篩選。不同細胞器皿轉染時培養(yǎng)液、DNA、Lipofect脂質體轉染試劑用■表96-well24-well12-well6-well6cmdish10cmdish鋪板培養(yǎng)液0.15ml0.5ml1ml2ml5ml10ml無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plDNA0.2pg0.8pg1.6pg4pg8pg24pg無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plLipofect脂質體轉染試劑0.5pl2pl4pl10pl20pl60pl注意：對于12孔板中一個孔的細胞,Lipofect脂質體轉染試劑的用量可以在3?10pl范圍內進行適當調節(jié)，DNA用量建議在1.6pg，旦也可在1?4pg范圍內進行適當調節(jié)。通常DNA用量(pg)和Lipofect脂質體轉染試劑(pl)用量比例為1:2?3，如有必要可在1:0.5?5的范圍內優(yōu)化轉染效果。為了獲得最佳的轉染效果，不同的細胞類型和培養(yǎng)條件有所不同，可在上述推薦范圍內自行優(yōu)化轉染條件。(二)siRNA轉染：1、 (以12孔板為例)在轉染前18~24h用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，取適量對數(shù)期細胞轉移至12孔板中，并將細胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，寺細胞密度達到即可進行轉染。后續(xù)操作步驟均按12孔板計算，如果轉染器皿不同，青按比例自行調節(jié)用量。2、 在加入待轉染的siRNA之前2~4h,加入不含抗生素的完全培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養(yǎng)液，旦抗生素使某些細胞轉染后出現(xiàn)一定的細胞毒性。3、 配制轉染工作液：取兩個無菌離心管，分別加入5不含抗生素和血清的培養(yǎng)液，取其中一離心管加入siRNA，輕輕混勻；取另一離心管加入Lipofect脂質體轉染試劑，輕輕混勻。室溫靜置，將含有siRNA的培養(yǎng)液用微量移液器輕輕加入含Lipofect脂質體轉染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置。4、 將上述轉染工作液逐滴滴入對應細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。5、 培養(yǎng)4~6h后，更換為含有血清的完全培養(yǎng)液。對于Hela細胞，推薦在轉染4h更換

培養(yǎng)液；對于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT細胞，推薦在轉染6h更換培養(yǎng)液。6、繼續(xù)培養(yǎng)后，觀察或收集細胞。不同細胞器皿轉染時培養(yǎng)液、siRNA、Lipofect脂質體轉染試劑用量表96-well24-well12-well6-well6cmdish10cmdish鋪板培養(yǎng)液0.15ml0.5ml1ml2ml5ml10ml無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plsiRNA5pmol20pmol40pmol100pmol200pmol600pmol無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plLipofect脂質體轉染試劑0.25pl1pl2pl5pl10pl30pl注意：對于12孔板中一個孔的細胞，Lipofect脂質體轉染試劑的用量可以在1?4pl范圍內進行適當調節(jié)，siRNA用量建議在范圍內進行適當調節(jié)。通常siRNA用量(pmol)和Lipofect脂質體轉染試劑(pl)的用量比例適量，如有必要可在10?40:1范圍內優(yōu)化轉染效果。為了獲得最佳的轉染效果，不同的細胞類型和培養(yǎng)條件有所不同，可以在上述推薦范圍內自行優(yōu)化轉染條件。siRNA的推薦濃度，常用的濃度范圍為。對于多個孔轉染相同數(shù)量相同質粒的情況可以把每個孔所需的Lipofect脂質體轉染試劑和siRNA混合物分別配制，然后一起混合在同一個離心管內，后續(xù)混勻并孵育后，按照推薦用量滴加到細胞培養(yǎng)器皿內。對于其它培養(yǎng)板或培養(yǎng)器皿，各種試劑的用量可以按照細胞培養(yǎng)器皿的培養(yǎng)面積按比例進行換算。如果轉染寡核苷酸或RNA等可以參考轉染DNA的條件進行。注意事項：1、 注意無菌操作，盡量避免污染，2、 使用高純度DNA或RNA有助于獲得較高的轉染效率，同時DNA不應含有蛋白和酚。3、 影響轉染效率的因素有很多，如細胞類型、細胞狀態(tài)及密度、DNA/siRNA轉染量、轉染試劑與DNA/siRNA比例等，應該在具體實踐中優(yōu)化來確定最佳轉染條件。4、 為了取得較高的轉染效率，推薦使用在50代以內的細胞進行轉染，轉染前細胞必須處于良好的生長狀態(tài)。5、 為了取得較高的轉染效率，推薦使用高純度的質粒，OD260/OD280>1.8o6、 Lipofect脂質體轉染試劑不應Vortex或離心，宜緩慢晃動混勻。7、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。有效期：12個月有效