淺談肝干細(xì)胞的有關(guān)研究

淺談肝干細(xì)胞的有關(guān)研究

王鳳華動(dòng)物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)系1.肝臟的胚胎發(fā)生

2.肝干細(xì)胞的發(fā)生

3.肝干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

4.肝干細(xì)胞的檢測(cè)

5.胚胎肝干細(xì)胞

6..前景及展望

干細(xì)胞是來源于胚胎、胎兒或成體內(nèi)具有在一定條件下無限制自我更新與增殖分化能力的一類細(xì)胞，能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型和自己完全相同的子細(xì)胞，也能產(chǎn)生組成機(jī)體組織、器官的已特化的細(xì)胞，同時(shí)還能分化為祖細(xì)胞。根據(jù)發(fā)生學(xué)來源，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是由胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外抑制培養(yǎng)而篩選出的。成體干細(xì)胞是存在于一種已經(jīng)分化組織中的未分化細(xì)胞，能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類型組織的細(xì)胞。如果根據(jù)分化潛能，干細(xì)胞分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、單能干細(xì)胞。專能干細(xì)胞是一類只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化的干細(xì)胞。肝干細(xì)胞是屬于成體干細(xì)胞和專能干細(xì)胞。學(xué)者們認(rèn)為，肝干細(xì)胞為肝內(nèi)膽管系統(tǒng)源性的多潛能分化細(xì)胞群，既可向膽管細(xì)胞分化，又可向肝細(xì)胞分化。以肝干細(xì)胞到成熟肝細(xì)胞的中間產(chǎn)物肝卵圓細(xì)胞（ovalcell,OVC）為代表的雙潛能細(xì)胞等均表現(xiàn)典型的干細(xì)胞特征。

自1937年Kinosita首次提出肝臟中存在可分化為肝細(xì)胞的干細(xì)胞樣細(xì)胞后，肝干細(xì)胞（hepaticstemcell）的存在就一直處于人們的關(guān)注和爭(zhēng)論中。近年來，由于對(duì)嚙齒類動(dòng)物及人類肝病發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)展，肯定了肝干細(xì)胞的存在。

有關(guān)肝干細(xì)胞的主要研究進(jìn)展有:通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了肝干細(xì)胞的存在;已公認(rèn)肝干細(xì)胞為卵圓細(xì)胞,但肝細(xì)胞本身也具有肝干細(xì)胞功能;卵圓細(xì)胞為多向性肝干細(xì)胞;肝外細(xì)胞如胰腺上皮細(xì)胞及骨髓細(xì)胞在體內(nèi)適當(dāng)條件下也可向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化;肝干細(xì)胞的活化與否及其多向性演變的發(fā)展受多種因素的調(diào)控,促進(jìn)肝再生各種因素促進(jìn)肝干細(xì)胞增生與演變。

1.肝臟的胚胎發(fā)生

胚胎發(fā)生過程中，肝臟的原胚有內(nèi)胚層和中胚層構(gòu)成，內(nèi)胚層的腹側(cè)原腸部發(fā)育成肝母細(xì)胞，進(jìn)一步分化為肝細(xì)胞。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和結(jié)締組織來源于被肝細(xì)胞索所分隔的間葉組織，原始肝母細(xì)胞包繞門脈間充質(zhì)，形成雙層肝細(xì)胞圓柱體，即“膽基板”，它在膽基板重構(gòu)過程中遷移入門脈間充質(zhì)，形成肝內(nèi)膽管，該類細(xì)胞在遷移進(jìn)入門脈間充質(zhì)的過程中，合成肝細(xì)胞特異性蛋白，即甲胎蛋白和清蛋白，并開始表達(dá)膽管特異性蛋白即谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。

2.肝干細(xì)胞的發(fā)生肝干細(xì)胞來源于前腸內(nèi)胚層,在胚胎發(fā)育過程中以肝細(xì)胞形式存在,在成年哺乳動(dòng)物肝臟中以小卵圓型細(xì)胞存在,表現(xiàn)為卵圓型小細(xì)胞、核大而胞質(zhì)少并具有特殊細(xì)胞標(biāo)志,因此又稱肝卵圓細(xì)胞(hep-aticovalcell,HOC),就其分化能力而言屬于第二級(jí)即前體細(xì)胞(progenitercell),在一定病生理?xiàng)l件下如毒感染或化學(xué)藥物等造成肝細(xì)胞喪失或壞死損傷時(shí)肝細(xì)胞從

G0期進(jìn)入細(xì)胞周期增殖，啟動(dòng)肝再生。如果肝臟受損嚴(yán)重以致于肝細(xì)胞大部分壞死或由于某些原因阻止或延遲殘余肝細(xì)胞再生時(shí),肝干細(xì)胞被激活，可向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞、胰腺外分泌上皮及免疫細(xì)胞等有限的幾種組織細(xì)胞分化,具有多向分化增殖潛力，與骨髓干細(xì)胞同樣具有多向分化的潛能，這一觀點(diǎn)已被普遍認(rèn)可。

肝干細(xì)胞來源大致上分為肝源性肝干細(xì)胞和非肝源性肝干細(xì)胞。前者有的分為膽管源性卵圓細(xì)胞和分化肝細(xì)胞，有的則分為成年動(dòng)物肝干細(xì)胞、胚胎肝干細(xì)胞。后者包括骨髓/造血干細(xì)胞(bonemarrowhaemat-opoeiticstemcell)、胰腺上皮細(xì)胞(prancreaticcell)、胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ES)。肝干細(xì)胞的分離培養(yǎng)是進(jìn)行體外研究重要部分，同時(shí)也為臨床應(yīng)用肝干細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ)。目前對(duì)于肝干細(xì)胞的分離，多采用熒光激活細(xì)胞篩選法（Fluorenscence-activatedcellsorting,FACS）利用流式技術(shù)結(jié)合免疫熒光標(biāo)記單克隆技術(shù)來分離，此方法分離效率和細(xì)胞純度顯著提高，但需要特異性較高的細(xì)胞膜表面標(biāo)志?，F(xiàn)已知肝干細(xì)胞表面表達(dá)C-kit、CD34、Thy-1、Flt-3、c-met等，但這都不是肝干細(xì)胞特異性標(biāo)志物。3.肝干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

Suzuketal采用FACS方法，從這13.5d胚齡的小鼠胎肝分離出c-kit-CD45f+CD45-TER119-細(xì)胞，體外培養(yǎng)和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有肝干細(xì)胞特征。Mongaetal運(yùn)用微切割技術(shù)從胎齡9.5d的胚肝中分離肝干細(xì)胞，培養(yǎng)液中含有肝細(xì)胞生長因子（HGF）\Flt-3因子、干細(xì)胞（SCF）因子,可獲得生長良好的肝前體細(xì)胞，并證明PARJA-1能作為肝干細(xì)胞的標(biāo)志。Ｔａｔｅｎｏ等研制出一種培養(yǎng)液,可長期支持肝細(xì)胞的連續(xù)生長而未失去其增生和分化功能。除含小牛血清外,主要含ＥＧＦ、煙酰胺(ＮＡＡ)、2磷酸維生素Ｃ及ＤＭＳＯ。

LazaroCA及其同事創(chuàng)建一種無血清人胚胎肝干細(xì)胞（HFHs）原代培養(yǎng)的方法，這些培養(yǎng)物可以在數(shù)月內(nèi)保持肝細(xì)胞的形態(tài)和基因表達(dá)，并且維持足夠的增生活性，能夠允許傳代培養(yǎng)至少2代以上。最初，HFHs包含2種主要細(xì)胞類型，其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)類似大的和小的肝細(xì)胞。人胚胎肝干細(xì)胞表達(dá)甲胎蛋白（AFP）、細(xì)胞角蛋白（CK）19、白蛋白及其它肝細(xì)胞蛋白。用制瘤素M處理培養(yǎng)細(xì)胞，通過肝細(xì)胞核因子（HNF）4α作用，可以促進(jìn)細(xì)胞增大，促進(jìn)細(xì)胞分化和膽小管形成。在平皿接種后大約1個(gè)月，培養(yǎng)物中出現(xiàn)多簇很小的細(xì)胞。這些細(xì)胞幾乎無細(xì)胞器，被認(rèn)為是胚樣細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析顯示它們可表達(dá)CD90（Thy-1）、CD34和OV-6等卵細(xì)胞/肝細(xì)胞標(biāo)志物。但是它們無法用β2-微球蛋白抗體染色。培養(yǎng)9-12個(gè)月的HFH可產(chǎn)生肉眼可見的有管狀結(jié)構(gòu)的類器官，其能被CK18、CK19和AFP染色。研究認(rèn)為能獲得一定數(shù)量的培養(yǎng)的肝干細(xì)胞為是研究多種人肝細(xì)胞包括病毒感染機(jī)理提供一個(gè)良好工具。

4.肝干細(xì)胞的檢測(cè)由于肝干細(xì)胞本身缺乏特異性標(biāo)記物，人們主要通過肝干細(xì)胞的分化潛能對(duì)肝干細(xì)胞作進(jìn)一步的鑒定。如雙潛能的肝干細(xì)胞可分化為肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞，它能同時(shí)表達(dá)表達(dá)肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞的標(biāo)記物，因而，可利用肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞的特異性抗體對(duì)肝干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。Pack等報(bào)道，細(xì)胞角蛋白CK7和CK19為膽上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志，白蛋白（albumin）和肝代謝酶細(xì)胞色素P450（如CYP1A2）可作為肝細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。甲胎蛋白（AFP）可在胎肝細(xì)胞和卵圓形細(xì)胞中表達(dá)，而在成熟干細(xì)胞中呈陰性反應(yīng)；細(xì)胞角蛋白CK8和CK18是肝上皮細(xì)胞的標(biāo)記，卵圓形細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞也表達(dá)這兩種抗體。OV-6抗體被認(rèn)為是嚙齒類動(dòng)物卵圓形細(xì)胞的特異標(biāo)記，Heather等的實(shí)驗(yàn)表明，它在正常人的胎肝和幼兒的肝臟中也有表達(dá)。

5.胚胎肝干細(xì)胞

由于成年肝臟中干細(xì)胞的含量非常少，研究者將目光投向胚胎肝臟，大部分實(shí)驗(yàn)研究基于大、小鼠胚肝。在鼠的肝臟中，卵圓細(xì)胞含量相對(duì)較高，2~5%，大鼠胚胎胚齡9.5-15d（小鼠胚齡8.5-15d）間，肝臟細(xì)胞形態(tài)均一，核漿少，有液泡。此間的肝細(xì)胞大部分被認(rèn)為有雙分化能力。Dabevaetal將從二肽酶Ⅳ（DPPV+）Fischer344大鼠肝臟中分離出的胎肝上皮細(xì)胞經(jīng)門靜脈輸入DPPV-F344大鼠肝臟（受體鼠肝臟先行2/3肝切除術(shù)，然后用retrosine處理），移植1mo后檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DPPIV+細(xì)胞延伸入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞顯型，形成新的肝索和膽管樣結(jié)構(gòu)。國內(nèi)蘇娟等從胎齡13天C57小鼠胚胎肝臟中成功分離干細(xì)胞樣肝原始細(xì)胞,AFP、CD34及白蛋白陽性,并呈集落樣生長。類似的許多試驗(yàn)都提供了這樣的結(jié)果。6..前景及展望從當(dāng)前研究水平看,預(yù)計(jì)肝干細(xì)胞的活化方法及分離培養(yǎng)程序仍將是近期研究的重點(diǎn);體外培養(yǎng)肝干細(xì)胞為人工肝提供細(xì)胞來源為生物型人工肝提供一種新的細(xì)胞來源,其強(qiáng)大的增殖能力為解決用于移植肝細(xì)胞的增殖困難及供