動物性食品衛(wèi)生學(xué)實驗

實驗一、菌落總數(shù)測定動物性食品衛(wèi)生學(xué)實驗實驗一、菌落總數(shù)測定一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握菌落總數(shù)測定的基本原理和方法；2、了解動物性食品上微生物的分布和繁殖動態(tài)。

實驗一、菌落總數(shù)測定二、實驗說明

菌落總數(shù)（aerobicplatecount）是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖動態(tài)，以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及其他生理條件（如溫度、培養(yǎng)時間、pH、需氧性質(zhì)等）去滿足其要求才能將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。但在實際工作中，一般都只用一種常用的方法去做。細(xì)菌菌落總數(shù)的測定，所得結(jié)果，只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數(shù)。實驗一、菌落總數(shù)測定三、檢驗程序檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)

10倍系列稀釋選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)每皿中加入15mL～20mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻培養(yǎng)

計數(shù)各平板菌落數(shù)

報告

計算菌落總數(shù)實驗一、菌落總數(shù)測定四、操作步驟（一）樣品稀釋1、固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min，制成1:10的樣品勻液。2、液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。實驗一、菌落總數(shù)測定四、操作步驟（一）樣品稀釋3、用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。4、按3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。實驗一、菌落總數(shù)測定四、操作步驟（一）樣品稀釋5、根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。6、及時將15~20mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。實驗一、菌落總數(shù)測定四、操作步驟（二）培養(yǎng)1、待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36±1℃培養(yǎng)48±2h。水產(chǎn)品30±1℃培養(yǎng)72±3h。2、如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按1條件進(jìn)行培養(yǎng)。實驗一、菌落總數(shù)測定四、操作步驟（三）菌落計數(shù)菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，CFU）表示。1、選取菌落數(shù)在30~300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。2、其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。3、當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。實驗一、菌落總數(shù)測定五、結(jié)果與報告（一）菌落總數(shù)的計算方法1、若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。2、若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算：實驗一、菌落總數(shù)測定五、結(jié)果與報告（一）菌落總數(shù)的計算方法N=∑C/（n1+0.1n2）d式中：N——樣品中菌落數(shù)；∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。實驗一、菌落總數(shù)測定五、結(jié)果與報告（一）菌落總數(shù)的計算方法稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）菌落數(shù)（CFU）232，24433，35N=∑C/（n1+0.1n2）d=（232+244+33+35）/【2+（0.1×2）】×10-2

=544/0.022=24727實驗一、菌落總數(shù)測定五、結(jié)果與報告（一）菌落總數(shù)的計算方法3、若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。4、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。5、若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。6、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30~300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

實驗一、菌落總數(shù)測定五、結(jié)果與報告（二）菌落總數(shù)的報告1、菌落數(shù)小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。2、菌落數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。3、若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。4、若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。5、稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。

動物性食品衛(wèi)生學(xué)實驗實驗二、大腸菌群計數(shù)實驗二、大腸菌群計數(shù)一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握大腸菌群計數(shù)的基本原理和方法；2、了解動物性食品的衛(wèi)生狀態(tài)。

二、實驗說明

大腸菌群(coliforms)是指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。實驗二、大腸菌群計數(shù)第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法第二法：大腸菌群平板計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)三、檢驗程序——第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)

10倍系列稀釋選擇適宜3個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管不產(chǎn)氣產(chǎn)氣BGLB肉湯36℃±1℃48h±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陽性36℃±1℃48h±2h查MPN表

報告結(jié)果

大腸菌群陰性月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯成分：胰蛋白胨或胰酪胨氯化鈉乳糖磷酸氫二鉀（K2HPO4）磷酸二氫鉀（KH2PO4）月桂基硫酸鈉蒸餾水煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯

成分：蛋白胨乳糖牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液0.1%煌綠水溶液蒸餾水實驗二、大腸菌群計數(shù)三、檢驗程序——第二法：大腸菌群平板計數(shù)法檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)

10倍系列稀釋選擇2-3個適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板計數(shù)典型和可疑菌落BGLB肉湯36℃±1℃48h±2h報告結(jié)果48h±2h36℃±1℃

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）成分：蛋白胨酵母膏乳糖氯化鈉膽鹽或3號膽鹽中性紅結(jié)晶紫瓊脂蒸餾水四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（一）樣品的稀釋

1、固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min，制成1:10的樣品勻液。2、液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（一）樣品的稀釋

3、樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。4、用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（一）樣品的稀釋

5、根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。

四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（二）初發(fā)酵試驗

每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（三）復(fù)發(fā)酵試驗

用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。四、操作步驟——第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（四）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告按（三）確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（一）樣品的稀釋

按第一法進(jìn)行。四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（二）平板計數(shù)

1、選取2～3個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。2、及時將15～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36±1℃培養(yǎng)18～24h。四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（三）平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15～150CFU之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（三）證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。

四、操作步驟——第二法：大腸菌群平板計數(shù)法實驗二、大腸菌群計數(shù)（四）大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（三）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4

樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。實驗三、四沙門氏菌檢驗動物性食品衛(wèi)生學(xué)實驗實驗三、四沙門氏菌檢驗一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握沙門氏菌檢驗的基本原理和方法；2、了解動物性食品檢驗沙門氏菌的意義。

實驗三、四沙門氏菌檢驗二、實驗說明

沙門氏菌（Salmonella）是一群形態(tài)和培養(yǎng)特性都類似的腸桿菌科中的一個大屬，也是腸桿菌科中最重要的病原菌屬。沙門氏菌均有致病性。根據(jù)對宿主適應(yīng)性不同，沙門氏菌分為三群：第一群具有高度適應(yīng)性，只對人或某種動物致??；第二群在一定程度適應(yīng)于特定動物；第三群非適應(yīng)性，廣泛感染的宿主譜，能引起人和各種動物的沙門氏菌病，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，占本屬的大多數(shù)。

沙門氏菌的血清型表示方法是O抗原：第1相抗原：第2相抗原實驗三、四沙門氏菌檢驗三、檢驗程序225g（mL）檢樣+225mLBPW36±1℃8±18hBSXLD（或HE、顯色培養(yǎng)基）1mL+SC10mL36±1℃18±24h1mL+TTB10mL42±1℃18±24h挑取可疑菌落36±1℃18±24h36±1℃40±48hTSI，賴氨酸，靛基質(zhì)，尿素(pH7.2)，KCN

生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)+

H2S+靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+H2S+靛基質(zhì)+尿素-KCN-賴氨酸+H2S-靛基質(zhì)-尿素-KCN-賴氨酸+/-

反應(yīng)結(jié)果與左側(cè)描述不符實驗三、四沙門氏菌檢驗三、檢驗程序甘露醇+、山梨醇+

ONPG-

非沙門氏菌沙門氏菌，血清學(xué)試驗報告BPW：緩沖蛋白胨水TTB：四硫磺酸鈉煌綠增菌液SC：亞硒酸鹽胱氨酸增菌液BS：亞硫酸鉍瓊脂XLD：木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂TSI：三糖鐵瓊脂KCN：氰化鉀培養(yǎng)基ONPG：鄰硝基酚β-D半乳糖苷培養(yǎng)基實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（一）前增菌稱取25g（mL）樣品放入盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000～10000r/min均質(zhì)1～2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36±1℃培養(yǎng)8～18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2～5℃不超過18h解凍。

實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（二）增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（三）分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落。實驗三、四沙門氏菌檢驗BS瓊脂：菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。實驗三、四沙門氏菌檢驗XLD瓊脂：菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。實驗三、四沙門氏菌檢驗HE瓊脂：藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。實驗三、四沙門氏菌檢驗沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（四）生化試驗1、自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h。實驗三、四沙門氏菌檢驗三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA＋（－）＋（－）＋可疑沙門氏菌屬KA＋（－）＋（－）－可疑沙門氏菌屬AA＋（－）＋（－）＋可疑沙門氏菌屬AA＋/－＋/－－非沙門氏菌KK＋/－＋/－＋/－非沙門氏菌注：K：產(chǎn)堿，A：產(chǎn)酸；＋：陽性，－：陰性；＋（－）：多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；＋/－：陽性或陰性。沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（四）生化試驗2、接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白胨水供做靛基質(zhì)試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h，按沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（1）判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復(fù)查。實驗三、四沙門氏菌檢驗反應(yīng)序號硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶A1＋－－－＋A2

＋＋－－＋A3－－－－＋/－注：＋陽性；－陰性；＋/－陽性或陰性。沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（1）實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（四）生化試驗2.1

反應(yīng)序號A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常，按沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（2）可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。

實驗三、四沙門氏菌檢驗pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果－－－甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）－＋＋沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙門氏菌個別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）注：＋表示陽性；＋表示陰性。

沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表（2）實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（四）生化試驗2.2反應(yīng)序號A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項試驗結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。

實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（四）生化試驗2.3反應(yīng)序號A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（四）生化試驗2.4

必要時按沙門氏菌屬各生化群的鑒別進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。項目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇＋＋－－＋－山梨醇＋＋＋＋＋－水楊苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸鹽－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示陽性;－表示陰性。

沙門氏菌屬各生化群的鑒別實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（四）生化試驗3、如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)1的初步判斷結(jié)果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

法國生物梅里埃ATB自動細(xì)菌鑒定儀微生物鑒定用試劑盒美國BILOG公司ELX808BLG自動細(xì)菌鑒定儀實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（五）血清學(xué)鑒定1、抗原的準(zhǔn)備

一般采用1.2％～1.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。

O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2％～3％）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55％～0.65％半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3％～0.4％半固體瓊脂的小玻管1次～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查

。

實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（五）血清學(xué)鑒定2、多價菌體抗原（O）鑒定在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min，并對著黑暗背景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。

玻板凝集試驗實驗三、四沙門氏菌檢驗四、操作步驟（五）血清學(xué)鑒定3、多價鞭毛抗原（H）鑒定同2。4、血清學(xué)分型（六）結(jié)果與報告綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理DNA的體外復(fù)制類似于天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性——退火——延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（一）原理1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；3、引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。實驗三、四沙門氏菌檢驗實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+1、引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+2、酶及其濃度：目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+3、dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCL的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+4、模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（二）反應(yīng)五要素引物、酶、dNTP、模板、Mg2+5、Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。1、變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。2、退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。3、延伸溫度與時間：一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（三）反應(yīng)條件溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。。

PCR擴(kuò)增儀實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（四）電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般在48h以內(nèi)進(jìn)行檢測，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。實驗三、四沙門氏菌檢驗實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測步驟1、引物：P1：5'-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3'，P2：5'-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3'；實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測步驟2、反應(yīng)體系：總體積為25μL，其中ddH2O15.25μL,10×PCRBuffer(含MgCl2)2.5μL，dNTP(2·5mmol/L)2μL，P1和P2(10μmol/L)各1.25μL，TaqDNA聚合酶0·25μL，模板DNA2.5μL。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測步驟3、反應(yīng)條件：94℃，5min94℃，30s60℃，30s35次循環(huán)

72℃，45s72℃，10min實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測步驟4、DNA的提?。簩⒈粰z菌株接種于3mLLB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)(100r/min)18~24h后，取1mL培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，經(jīng)10000r/min4℃離心5min，棄去上清液，用200μLddH2O或者TE緩沖液(pH8.0)重懸沉淀，再于沸水浴中10min，隨后立即在冰中冷卻，然后在10000r/min及4℃條件下離心5min，取上清液為沙門氏菌基因組DNA模板。實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（五）沙門氏菌檢測步驟5、電泳檢測：取5μLPCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）電泳，凝膠成像儀上觀察拍照結(jié)果。實驗三、四沙門氏菌檢驗21株沙門氏菌PCR擴(kuò)增電泳圖1-10，14-24為沙門氏菌分離菌株；12為DNAMarkerDL2000；11為沙門氏菌陽性對照；13為陰性對照實驗三、四沙門氏菌檢驗五、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）（六）特點1、特異性強(qiáng)2、靈敏度高3、簡便、快速4、對標(biāo)本的純度要求低實驗五、旋毛蟲病檢疫動物性食品衛(wèi)生學(xué)實驗實驗五

旋毛蟲病檢疫一、目的與要求1、學(xué)習(xí)掌握旋毛蟲病的檢疫技術(shù)；2、了解旋毛蟲病的診斷要點和意義。

旋毛蟲病是由旋毛蟲引起的人獸共患寄生蟲病。成蟲（腸旋毛蟲）寄生在哺乳動物的腸內(nèi)，幼蟲（肌旋毛蟲）寄生在肌肉組織中且形成包囊。多種動物均可感染，肉用動物中主要感染豬和狗。本病對人危害較大，可致人死亡。人旋毛蟲病的發(fā)生主要是由于攝食了生的或未煮熟的含旋毛蟲包囊的豬肉，其次是狗肉。實驗五旋毛蟲病檢疫二、實驗說明1、人和動物吞食了含有侵襲性旋毛蟲（成熟的肌旋毛蟲）而受到感染。2、旋毛蟲成蟲與蚴蟲的發(fā)育同在一個宿主體內(nèi)完成。寄生于宿主小腸（十二指腸、空腸）的成蟲稱腸旋毛蟲；寄生于宿主肌肉組織中的蚴蟲稱肌旋毛蟲。肌旋毛蟲常寄生于膈肌、舌肌、喉肌、頸肌、肋間肌和腰肌等處，其中以膈肌感染率最高，且多聚積在筋頭。3、實驗證明形成包囊的旋毛蟲和未形成包囊的某一生活階段的蚴蟲，均具有感染人和動物的能力。實驗五旋毛蟲病檢疫

人感染旋毛蟲后，在病的初期出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉。隨后表現(xiàn)乏力、畏寒、頭痛、發(fā)熱等類似感冒癥狀；并發(fā)生全身肌肉呈持續(xù)性癢痛，尤以下肢腓腸肌和腰部為明顯；同時出現(xiàn)眼瞼、面部乃至下肢浮腫。有的病人呈現(xiàn)腦炎、腦膜炎、心肌炎等癥狀。后期，急性炎癥消退，除肌肉長期隱痛及四肢乏力外，一般沒有什么癥狀；耐過患者經(jīng)一定時間后體力完全恢復(fù)。實驗五旋毛蟲病檢疫宰前檢驗：ELISA（動物感染后大都有一定耐受力，往往不顯癥狀。但感染嚴(yán)重的豬和狗，初期食欲減退，嘔吐、腹瀉，以后幼蟲移行時可引起肌炎，病畜出現(xiàn)肌肉疼痛，麻痹，運動障礙，聲音嘶啞，發(fā)熱等癥狀）實驗五旋毛蟲病檢疫宰后檢驗：主要是病原學(xué)檢查法，其中仍以目檢和鏡檢相結(jié)合的壓片鏡檢法和集樣消化法不失其實用價值。

實驗五

旋毛蟲病檢疫三、實驗內(nèi)容壓片鏡檢法⑴采取被檢肌樣：按規(guī)定自肉尸、胴體兩側(cè)橫隔膜肌腳，各取樣1份，每份（兩塊）重量不少于30-50克。與胴體、肉尸編成同一號碼以便檢疫對照。⑵目檢：撕去隔肌膜，在充足的陽光下，仔細(xì)視檢肉樣表面有無半透明的隆起乳白色、灰白色小點。凡發(fā)現(xiàn)上述小點時，均應(yīng)仔細(xì)剪下，制成壓片鏡檢。實驗五

旋毛蟲病檢疫⑶壓片標(biāo)本制作：剪取小肉樣制作壓片。用剪刀順肌纖維方向，按隨機(jī)取樣的要求，從檢樣肉上剪取米粒大小的肉24粒，均勻地在夾壓玻璃片上排成兩排，每排12粒。然后壓片，放低倍（50-70倍）顯微鏡下檢查。⑷鏡檢：先從壓片一端第一塊肉片（粒）的邊沿開始，順肌纖維全部觀察，直到他端最后一塊肉片為止。

實驗五

旋毛蟲病檢疫肌旋毛蟲肌旋毛蟲實驗六布魯氏菌病的檢疫動物性食品衛(wèi)生學(xué)實驗實驗六、布魯氏菌病的檢疫1、學(xué)習(xí)掌握布魯氏菌病檢疫的基本原理和方法；2、了解血清學(xué)試驗在布魯氏菌病檢疫中的作用。

一、目的與要求實驗六、布魯氏菌病的檢疫二、實驗說明布魯氏菌?。˙rucellosis，又稱布氏桿菌病，簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮偌?xì)菌引起的人獸共患的常見傳染病。我國將其列為二類動物疫病。診斷：⑴流行特點，⑵臨床癥狀，⑶病理變化，⑷實驗室診斷（①病原學(xué)診斷a顯微鏡檢查、

b分離培養(yǎng)

②血清學(xué)試驗c虎紅平板凝集試驗RBPT、d全乳環(huán)狀試驗MRT、e試管凝集試驗SAT、f補(bǔ)體結(jié)合試驗CFT）實驗六、布魯氏菌病的檢疫二、實驗說明結(jié)果判定

：1、具有⑴、⑵、⑶時，判為疑似。2、符合1，且a或b陽性時，判為患病動物。3、若為未免疫動物，則：

▲c或d陽性時，判為疑似。

◆b或e或f陽性時，判為患病動物?！锓稀玡或f陰性時，30天后應(yīng)重新采樣檢測，c或e或f陽性的判為患病動物。

實驗六、布魯氏菌病的檢疫二、實驗說明布病最常用的檢疫技術(shù)是血清學(xué)診斷。目前我國常用的血清學(xué)方法有RBPT、SAT和CFT以及MRT。實驗六、布魯氏菌病的檢疫三、實驗內(nèi)容——

RBPT適用于家畜布病的田間篩選。（一）材料準(zhǔn)備1、抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。2、受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。3、潔凈的玻璃板，其上劃分成4cm2

的方格。4、吸管或分裝器，適于滴加0.03mL。5、牙簽或火柴桿，供攪拌用。（二）操作方法1、將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號，然后加相應(yīng)血清0.03mL。2、在受檢血清旁滴加抗原0.03mL。3、用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合。4、每次試驗應(yīng)設(shè)陰、陽性血清對照。實驗六、布魯氏菌病的檢疫三、實驗內(nèi)容——RBPT（三）結(jié)果判定1、在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進(jìn)行判定。2、受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（－）。陽性：出血明顯凝集顆粒（箭頭）陰性：不出現(xiàn)凝集顆粒實驗六、布魯氏菌病的檢疫四、實驗內(nèi)容——SAT適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。（一）材料準(zhǔn)備1、稀釋液

0.5%石炭酸生理鹽水。檢驗羊血清時用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋亦用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液。2、抗原、陽性血清和陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。3、凝集試驗管（三分管）試管架、吸管及溫箱。實驗六、布魯氏菌病的檢疫四、實驗內(nèi)容——SAT（二）操作方法1、按常規(guī)方法采血分離血清。2、運送和保存血