第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞生物學(xué)CellBiology課件制作與講授:楊谷良Theanalyseofacell’scontents二

細(xì)胞組分分析方法2細(xì)胞組分的分析方法2.1離心技術(shù)Centrifugation?是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。?轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。?轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。?目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)10萬(wàn)r/min，離心力超過500Kg。48離心分離技術(shù)

不同的細(xì)胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。常用的兩類離心分離方法是速度離心(velocitycentrifugation)和等密度離心(isodensitycentrifugation)

49蔗糖或者甘油(它們的最大密度是1.3g/cm3)通?？捎糜诜蛛x膜結(jié)合的細(xì)胞器，如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和線粒體。

離心分離密度大于1.3g/cm3的樣品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介質(zhì)。重金屬鹽氯化銫(CsCl)是目前使用的最好的離心介質(zhì)，它在離心場(chǎng)中可自行調(diào)節(jié)形成濃度梯度，并能保持穩(wěn)定。在氯化銫形成的密度梯度中，離心管頂部的密度為:1.65g/cm3，底部為:1.75g/cm3。因?yàn)镈NA的密度是1.70g/cm3，會(huì)停留在離心管的中部)。

50不同的細(xì)胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉降系數(shù)

51差速離心(differentialcentrifugation)

主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的

52等密度離心離心適當(dāng)時(shí)間，樣品中的顆粒向管底部移動(dòng)，由于體積的不同，移動(dòng)的區(qū)帶速度不同。常用的介質(zhì)有蔗糖、多聚蔗糖、氯化銫等

53介質(zhì)需要具有以下特點(diǎn)：密度逐漸增加高溶解性惰性物質(zhì)14蔗糖密度梯度離心：用于分離密度相近而大小不同的組分。

CsCl密度梯度離心重金屬鹽氯化銫(CsCl)在離心場(chǎng)中可自行調(diào)節(jié)形成濃度梯度，并能保持穩(wěn)定，用于分離不同密度的細(xì)胞組分。54層析分離技術(shù)(chromatography)

層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計(jì)的物理分離方法。目前最常用的層析方法有凝膠過濾層析離子交換層析親和層析等55凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)

又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化

56親和層析(affinitychromatography)

當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開

57離子交換層析(ion-exchangechromatography)

不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，在一定的條件下解離后所帶的電荷種類和電荷量都不同，因而可與不同的離子交換劑以不同的親和力相互交換吸附。582.2細(xì)胞組分的顯示方法59一些顯色劑可以與所要檢測(cè)物的特殊基團(tuán)特異結(jié)合，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷物質(zhì)的分布情況和相對(duì)含量。DNA—福爾根反應(yīng)：酸水解去除RNA及DNA上的嘌呤，使醛基暴露出來(lái)，暴露的醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色。脂肪滴—四氧化餓與脂肪酸反應(yīng)呈黑色蛋白質(zhì)—米倫反應(yīng)：氮汞試劑與蛋白質(zhì)側(cè)鏈酪氨酸殘基反應(yīng)呈紅色。蛋白質(zhì)—重氮反應(yīng)：氫氧化重氮與酷氨酸、色氨酸、組氨酸反應(yīng)形成有色復(fù)合物，2.1離心技術(shù)2細(xì)胞組分的分析方法2.2顯示方法2.3細(xì)胞免疫化學(xué)?根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。?免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。?酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：用酶代替熒光素與抗體耦聯(lián)，常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。60?免疫電鏡技術(shù)：將抗體進(jìn)行特殊標(biāo)記后用電子顯微鏡觀察免疫反應(yīng)的結(jié)果》免疫鐵蛋白技術(shù)》免疫酶標(biāo)技術(shù)》免疫膠體金技術(shù)?應(yīng)用：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。61利用免疫膠體金技術(shù)標(biāo)記核骨架622細(xì)胞組分的分析方法2.4分子生物學(xué)方法

?包括基因重組技術(shù)、基因轉(zhuǎn)移、分子雜交、PCR反應(yīng)、序列分析等等

63基因工程技術(shù)(geneengineering)

基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因(DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段

6465選擇性基因敲除(geneknockout)

是指一個(gè)有功能的基因通過基因工程方法完全被剔除的人工突變技術(shù)。人為的將小鼠的某一種有功能的基因完全缺失的技術(shù)就稱為基因敲除技術(shù)。應(yīng)用于幾種遺傳病的研究，還可用于研究特定基因的細(xì)胞生物學(xué)活性以及研究發(fā)育調(diào)控的基因作用等

66轉(zhuǎn)基因敲除小鼠的獲得

672.4分子雜交技術(shù)（一）原位雜交insituhybridization

（二）Southern雜交

?是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。?

將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。682.1離心技術(shù)2細(xì)胞組分的分析方法2.2顯示方法2.3細(xì)胞免疫化學(xué)2.4分子雜交技術(shù)2.5放射自顯影技術(shù)放射自顯影術(shù)（radioautography；autoradiography）用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。692.5放射自顯影技術(shù)原理：將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。實(shí)驗(yàn)室一般常選用14C和3H標(biāo)記。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TDR）來(lái)顯示DNA，用3H尿嘧啶核苷（3H-UDR）顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，研究多糖則用3H甘露糖、3H巖藻糖等。702細(xì)胞組分的分析方法2.6流式細(xì)胞儀71流式細(xì)胞儀Flowcytometer?用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。流式細(xì)胞計(jì)分選細(xì)胞示意圖

722.7分光光度技術(shù)：細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜能夠吸收，據(jù)此測(cè)定這些物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的含量。如DNA最高吸收高峰在260nm。3.1細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture）就是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機(jī)體中取出的細(xì)胞，并使之生長(zhǎng)和生存的技術(shù)。733.1細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程3.1.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)74Primaryculture&Subculture

原代培養(yǎng)細(xì)胞，primaryculture,指直接從機(jī)體出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞，通常把第1代至地10代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞。

傳代培養(yǎng)細(xì)胞，Subculture,指適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。（又分為有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系）75群體培養(yǎng)&克隆培養(yǎng)群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

群體培養(yǎng)massculture：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層；克隆培養(yǎng)clonalculture：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。76基本定義1．

原代培養(yǎng)（primaryculture）：從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長(zhǎng)，需要從更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。2．

細(xì)胞株（cellstrain）：經(jīng)生物學(xué)鑒定，具有特殊生物學(xué)特性或者標(biāo)記的細(xì)胞克隆。3．

細(xì)胞系（cellline）：在培養(yǎng)過程中，少數(shù)細(xì)胞可以持續(xù)傳代40-50次，并且依然保持原來(lái)染色體的二倍體水平以及接觸掏的行為的這類細(xì)胞。77有限細(xì)胞系：當(dāng)傳代到50代以后不能再繼續(xù)傳下去的細(xì)胞系，因其傳代次數(shù)有限，稱為有限細(xì)胞系。5。連續(xù)細(xì)胞系：在持續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，部分細(xì)胞發(fā)生了遺傳突變，并且使其帶有癌細(xì)胞特點(diǎn)，有可能在培養(yǎng)條件下無(wú)限制地傳代下去的這種傳代細(xì)胞。6．

克隆（clone）：亦稱無(wú)性繁殖系或簡(jiǎn)稱無(wú)性系。對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。貼壁培養(yǎng)

分散的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分鐘至幾小時(shí))就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁，貼壁后的細(xì)胞形態(tài)形成多態(tài)性，呈單層生長(zhǎng)，所以此法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的細(xì)胞保持接觸抑制(contactinhibition)的特性。

783.1細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程3.1.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)3.1.2植物細(xì)胞培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點(diǎn)：–①比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)，如DNA；–②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；–③適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。79植物細(xì)胞培養(yǎng)80植物原生質(zhì)體培養(yǎng)

將原生質(zhì)體放在合適的培養(yǎng)基上，經(jīng)過誘導(dǎo)分化可以重新長(zhǎng)成植株。原生質(zhì)體也可用于植物細(xì)胞融合，

然后誘導(dǎo)形成新的植株。

81產(chǎn)業(yè)化的植物組織培養(yǎng)823.1細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程3.1.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)3.1.2植物細(xì)胞培養(yǎng)3.1.3非細(xì)胞體系Cellfreesystem,來(lái)源于細(xì)胞，而不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但包含了進(jìn)行正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)組成（如功能體系和酶反應(yīng)體系等）的體系即為非細(xì)胞體系。833.1細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程3.2細(xì)胞工程Cellengineering

通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合（cellfusion）或細(xì)胞雜交（cellhybridization）。3.2.1細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：生物方法（仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。有性繁殖時(shí)發(fā)生的精卵結(jié)合是正常的細(xì)胞融合84Cellfusion?同核體homokaryon：相同基因型的細(xì)胞融合而成。?異核體heterokaryon：不同基因型的細(xì)胞融合而成。?融合核細(xì)胞synkaryon：通過細(xì)胞雜交形成的單核子細(xì)胞稱融合核細(xì)胞853.1細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程3.2細(xì)胞工程Cellengineering3.2.1細(xì)胞融合3.2.2單克隆抗體Monoclonalantibody?正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國(guó)人Kohler和Milstein1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，Monoclonalantibody，獲1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎(jiǎng)（M&P）。86單克隆抗體制備過程示意圖8713.1細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程3.2細(xì)胞工程Cellengineering3.2.1細(xì)胞融合3.2.2單克隆抗體Monoclonalantibody3.2.3顯微操作技術(shù)Micromanipulation,用顯微操作裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解剖和顯微注射（microinjection）的技術(shù)。88顯微操作系統(tǒng)89利用顯微操作技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠90動(dòng)物細(xì)胞核移植克隆技術(shù)

1997年，英國(guó)蘇格蘭羅斯林研究所I.WI.Wilmut等首次成功通過細(xì)胞融合技術(shù)利用成年動(dòng)物徹底分化的體細(xì)胞克隆出子代個(gè)體，開創(chuàng)了動(dòng)物體細(xì)胞克隆的新時(shí)代。

細(xì)胞核移植克隆綿羊

91乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)乳腺生物反應(yīng)器是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)中蛋白質(zhì)合成與分選的機(jī)理，結(jié)合基因工程技術(shù)、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，利用動(dòng)物的乳腺分泌某些具有重要價(jià)值的基因產(chǎn)物

92用轉(zhuǎn)基因綿羊生產(chǎn)重要的醫(yī)用蛋白質(zhì)

93四、細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化1熒光漂白恢復(fù)技術(shù)使用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢測(cè)所標(biāo)記分子在活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)動(dòng)及其遷移速率。FPR技術(shù)的原理是：利用高能激光照射細(xì)胞的某一特定區(qū)域，使該區(qū)域內(nèi)標(biāo)記的熒光分子不可逆的淬滅，這一區(qū)域稱熒光漂白（photobleaching）區(qū)。隨后，由于細(xì)胞質(zhì)中的脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，周圍非漂白區(qū)熒光分子不斷向光漂白區(qū)遷移。結(jié)果使熒光漂白區(qū)的熒光強(qiáng)度逐漸地回復(fù)到原有水平。包括三個(gè)步驟：熒光染料與膜成分交聯(lián)；激光照射猝滅（漂白）膜上部分熒光；檢測(cè)猝滅部位熒光再現(xiàn)速率2、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)原理：兩種目的蛋白分別與兩種熒光蛋白[藍(lán)綠色熒光蛋白（CFP）的發(fā)射光譜與黃色熒光蛋白（YFP）]融合表達(dá)，由于兩種熒光蛋白的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時(shí)，用CFP的吸收波長(zhǎng)激發(fā)，CFP的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對(duì)空間位置的改變非常靈敏。如果兩種蛋白沒有發(fā)生相互作用時(shí)，CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測(cè)到的是CFP的發(fā)射的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時(shí)，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測(cè)到的就是YFP的發(fā)射的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。應(yīng)用其它研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，諸如：酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標(biāo)記等方法應(yīng)用的前提都是要破碎細(xì)胞或?qū)?xì)胞造成損傷，無(wú)法做到在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)的對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。

放射自顯影技術(shù)是用感光膠片測(cè)定細(xì)胞內(nèi)某種被放射性標(biāo)記的物質(zhì)在細(xì)胞固定時(shí)所在的位置，基本過程如右圖所示。3、放射自顯影技術(shù)174、用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物模式生物：一些相對(duì)簡(jiǎn)單的生物因?yàn)榫哂屑?xì)胞數(shù)量少，分布相對(duì)單一，變化較好觀察等優(yōu)點(diǎn)。由于進(jìn)化的原因，細(xì)胞生命在發(fā)育的基本模式方面具有相當(dāng)大的同一性，所以利用位于生物復(fù)雜性階梯較低級(jí)位置上的物種來(lái)研究發(fā)育共通規(guī)律是可能的,尤其是當(dāng)在有不同發(fā)育特點(diǎn)的生物中發(fā)現(xiàn)共同形態(tài)形成和變化特征時(shí)，發(fā)育的普遍原理也就得以建立。所以它們被稱為“模式生物”。常見的模式生物有:病毒、細(xì)菌、酵母、原生動(dòng)物、黏菌、蛙、海膽、線蟲、果繩、斑馬魚、小鼠等．模式生物的特點(diǎn):1)生理特征能夠代表生物界的某一大類群；

2)容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖；

3)容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,特別是遺傳學(xué)分析。怎樣選擇一個(gè)合適的模式生物?1選擇的模式生物必須可以用來(lái)研究想要研究的問題，2盡量先選擇最簡(jiǎn)單的一種。例:研究細(xì)胞凋亡的研究。只有多細(xì)胞生物才會(huì)進(jìn)行凋亡，單細(xì)胞生物是不會(huì)的。那么單細(xì)胞生物就不能用來(lái)研究凋亡，理論上任何多細(xì)胞生物都可以。事實(shí)上細(xì)胞凋亡的研究使用的正是最簡(jiǎn)單的多細(xì)胞模式生物：線蟲。該研究獲2002年Nobel生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。４．１病毒（virus）特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單：基因組5-270kb，由少數(shù)蛋白質(zhì)殼體和遺傳物質(zhì)核酸組成．具有生命形式的兩重性細(xì)胞外形式與細(xì)胞內(nèi)形式必需進(jìn)入細(xì)胞才能進(jìn)行ＤＮＡ復(fù)制．應(yīng)用：１作為目的基因載體，使之連接到目的細(xì)胞染色體上．用來(lái)研究生物大分子相互作用，基因表達(dá)調(diào)控２腫瘤發(fā)生與防治．４．２細(xì)菌（Bacteria

）－大腸桿菌（Escherichiacoli）人和許多動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌。特點(diǎn)：只有一條環(huán)狀ＤＮＡ鏈，基因組序列測(cè)定完成（4.6*103bp）,約編碼4288個(gè)基因．培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)快，突變株誘變、分離與鑒定容易，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，基因定位簡(jiǎn)單易行。應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控、基因定位。4.3酵母（yeast）－單細(xì)胞真核生物的代表特點(diǎn)：個(gè)體小、培養(yǎng)方便、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟；具有真核細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)：細(xì)胞核與各種細(xì)胞器。染色體結(jié)構(gòu)具有自主復(fù)制序列、著絲點(diǎn)序列、端粒序列。芽殖酵母（G1期很長(zhǎng)），裂殖酵母（G2期很長(zhǎng)）條件敏感型與人類基因同源應(yīng)用：細(xì)胞周期研究：芽殖，研究G1/S期轉(zhuǎn)換裂殖，研究G2/M期轉(zhuǎn)換。研究細(xì)胞分裂與周期調(diào)控許多基因與人類同源。4.4線蟲－秀麗隱桿線蟲（C.elegans）特點(diǎn)：基因組序列測(cè)定