第三章蛋白質(zhì)研究技術(shù)

第三章蛋白質(zhì)研究技術(shù)

第一節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化第二節(jié)蛋白質(zhì)的鑒定第三節(jié)蛋白質(zhì)的檢測第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析第一節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化

一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則二、蛋白質(zhì)分離純化的方法

蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化概圖一、蛋白質(zhì)分離純化的基本原則

1、選擇豐度高、便于提取的材料（磷酸單脂酶,肝、胰、脾豐富，但選幾乎不含磷酸二脂酶的前列腺）2、了解目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（肝素材料的冷凍和干燥）3、探索有效的抽提和濃縮方法

(包括細胞破碎，抽提系統(tǒng)，濃縮：沉淀、吸附、超濾、透析、凍干等)4、建立一套層析組合方法和檢測方法

（如吸附、離子交換、親和層析、凝膠過濾；純化評價）5、包裝、貯存方法（生產(chǎn)日期、批次、含量或效價）二、蛋白質(zhì)分離純化的方法粗提：1.鹽析:固體加入法：飽和溶液加入法:2.有機溶劑沉淀:3.結(jié)晶（10-50mg/ml）

4.等電點沉淀精提：1.離心（centrifugation）2.電泳（electrophoresis）

3.層析（chromatography）注：S1:原飽和度；S2：預(yù)期飽和度；S3：加入液飽和度。V：欲加入體積（ml）；V0：原液體積1.離心（centrifugation）

原理：懸液中的各種粒子（細胞，細胞器及大分子）有不同質(zhì)量（mass）或密度（density），故在離心場中有不同沉降速率。

蛋白質(zhì)分子量差別很大，密度差別很小（不超過15%）。蛋白質(zhì)的平均密度是1.37g/cm3。結(jié)合蛋白密度差異較大。沉降系數(shù)（sedimentationconstant）：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度（S）。離心（centrifugation）

①.差速離心（differentialcentrifugation）②.速率區(qū)帶離心（rate-zonalcentrifugation）①.差速離心（differentialcentrifugation）

利用不同物質(zhì)沉降速率的差異，通過離心速度差異分離不同質(zhì)量顆粒的離心技術(shù)。

從組織勻漿中將可溶性的蛋白質(zhì)與不溶性成分分開。離心后，蛋白質(zhì)留在上清液（Supernatant）中，其他成分形成沉淀（Pellet）細胞成份的差速離心分離離心力

時間②.速率區(qū)帶離心（rate-zonalcentrifugation）

也稱平衡密度梯度離心，根據(jù)顆粒在介質(zhì)中的沉降速度差異分離目標(biāo)顆粒的方法。蔗糖、甘油或氯化銫形成密度梯度；超速離心機（≈40,000r/min）離心后，分離物分布在相應(yīng)的密度區(qū)帶內(nèi)；

注意：控制時間：太短，不能充分分離；太長，分離物沉淀到離心管底部。不能精確測定分子量，因為蛋白質(zhì)的形狀差異影響沉降率；一次分離多種不同類型聚合物或顆粒的最有效方法

多用于分離細胞器，ＤＮＡ2.電泳（electrophoresis）

帶電顆粒在電場中的移動速度的差異,從而將其分離。由電荷–質(zhì)量比決定。按支持物:移動界面電泳,聚焦電泳,區(qū)帶電泳（凝膠、線絲）等按電泳裝置:水平平板,垂直平板,圓盤,雙向電泳,毛細管電泳，脈沖電泳。①SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）②等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）③雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）④脈沖電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）常用的電泳方法①.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）凝膠丙烯酰胺（acrylamide），甲叉雙丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成；T%=(a:單體g;b:雙體g;m:溶液體積)凝膠孔徑：選擇丙烯酰胺濃度，甲叉雙丙烯酰胺膠聯(lián)劑的濃度；C%=(a:b=19:1)凝膠有分子篩效應(yīng)。a+bm100%ba+b100%acrbisSDSSDS（sodiumdodecylsulfate）陰離子洗滌劑，幾乎能破壞天然蛋白質(zhì)中所有的非共價鍵，使亞基解聚(巰基乙醇)，使多肽鏈呈伸展?fàn)顟B(tài)，消除了蛋白質(zhì)構(gòu)形對遷移率（migrationrate）的影響；

SDS以1:2的比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負電荷，而且電荷量與蛋白質(zhì)分子量（即肽鏈長度）成正比。所以分子量成為決定蛋白質(zhì)遷移率的唯一因素。SDSSDS分離的蛋白質(zhì)可以用Coomassieblue染色，也可銀染（silverstain）SDS能分離分子量差異小于10%的蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)純化和分子量近似值測定②.等電聚焦（isoelectricfocusing,IEF）在凝膠上加入一種兩性電解質(zhì)（ampholyte），電泳時會形成連續(xù)的pH梯度電泳后，各種蛋白質(zhì)停留在與其等電點（pI）相同的位置IEF能分離pI值僅相差0.01的蛋白質(zhì)（即一個凈電單位）等電聚焦電泳過程中不連續(xù)電泳的三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)③.雙向電泳（two-dimensional

gelelectrophoresis）分離分子量差異很小的蛋白質(zhì)

雙向電泳=IEF+SDS

第一向：根據(jù)電荷差異用IEF分離第二向：根據(jù)分子量差異用SDS分離雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）IEFSDS雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）

蛋白質(zhì)可用染色法（銀染、考馬斯藍

）或放射自顯影進行檢測；斑點挖取做質(zhì)譜鑒定。④.脈沖電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）用于分離大片段DNA（20kb-10Mb）在電場中，大片段DNA以伸展的方式進行移動斷電后，DNA分子卷曲成不規(guī)則形狀。

DNA從伸展到卷曲所需要的時間與其長度成正比然后改變電泳方向90°或180°再次通電如此反復(fù)進行，逐步把不同大小的DNA分開3.層析（chromatography）原理：溶液中的分子能與固體表面進行結(jié)合及解離，但由于蛋白質(zhì)在分子量、帶電性和結(jié)合特異性方面的差異，導(dǎo)致與固體表面結(jié)合與解離的難易程度不一樣，所以流動的速度也不一樣。

固定相的性質(zhì)決定被分離蛋白的分離效率流動相固定相凝膠類型及型號與蛋白質(zhì)分子量葡聚糖與多孔瓊脂糖珠共價交聯(lián)（吸水量是型號1/10）瓊脂糖凝膠丙烯葡聚糖凝膠層析（chromatography）①.凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography）②.離子交換層析（ion-exchangechromatography）③.親和層析（affinitychromatography）

①.凝膠過濾層析（gelfiltration

chromatography）

分離分子量有差異的蛋白質(zhì)；多孔小珠由聚丙烯酰胺（polyacrylamide）、葡聚糖（dextran）或瓊脂糖（agarose）組成；葡聚糖顆粒大分子

小分子凝膠過濾層析小分子進入顆粒凝膠內(nèi)部，而大分子被排阻在外，因此小分子在層析柱中流動速度慢，從而把混合物按不同分子量分開可根據(jù)洗脫體積（elutionvolume）估計蛋白質(zhì)分子量，分子量大洗脫體積小?；驹砟z上柱后，顆粒外的外水體積（Vo），顆粒內(nèi)體積稱內(nèi)水體積（Vi），顆粒中膠的體積（Vg），因而，總的柱床體積（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi。當(dāng)進行洗脫時，某一溶質(zhì)的洗脫體積（Ve）就取決于Vo，Vi和在兩相中的分配系數(shù)（kd）Ve=Vo+kd·Vi

①當(dāng)kd=0時,Ve=Vo，溶質(zhì)全從Vo出來，無分配。②當(dāng)kd=1時,Ve=Vo+Vi,溶質(zhì)全進篩子，各物質(zhì)盡管有分配，但各物質(zhì)不能分開。③當(dāng)0<kd<1時,Ve=Vo+kd·Vi各溶質(zhì)具不同分配，以得到分離。若已知某一物質(zhì)的kd，可據(jù)上式計算它的洗脫體積（Ve）也可用溶質(zhì)洗脫峰處的洗脫體積來測量。用此法來分離介質(zhì)是以下述三種形式來描述的：②.離子交換層析（ion-exchange

chromatography,IEC）分離所帶電荷不同的物質(zhì)，離子交換的支持物稱為離子交換劑。

離子交換劑分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子

離子交換劑包括：離子交換樹脂（anionexchangeresin）和離子交換纖維素（cationexchangeresin）,如DEAE-cellulose和CM-cellulose。

不同的蛋白質(zhì)與交換劑有不同的親和力，因而可用不同鹽濃濃度或pH值的buffer洗脫洗脫示意圖結(jié)合洗脫曲線離子交換層析（ion-exchangechromatography）③.親和層析（affinitychromatography）親和層析：利用分子與其配體間特殊的、可逆性的親和作用而進行分離的一種層析技術(shù)。配體：抑制劑、活化劑、輔酶（輔基）、底物及類似物、抗體、受體等（如外源凝集素、金屬離子等）；上柱結(jié)合：與配體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)被滯留在層析柱中，其他(雜質(zhì))成分流出；洗脫：加入過量的配體、配體類似物或改變洗脫液濃度（或pH）使結(jié)合的蛋白質(zhì)被頂替下來。雜質(zhì)溶液偶聯(lián)親和層析的基本要素親和層析金屬螯合層析法（MCAE）固定相4.膜蛋白的分離方法

膜蛋白：指與生物膜鑲嵌、結(jié)合或附著的一系列蛋白質(zhì)。2004年蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的3D提交物已超過22,000個，但幾乎都為可溶性蛋白，只有不到1%是膜上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。膜蛋白是一種難以分離和純化的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)從質(zhì)膜中分離時，暴露出來的疏水區(qū)相互作用，引起蛋白質(zhì)聚集、沉淀.去污劑（detergents）是一種兩親分子，能嵌入到磷脂雙層（phospholipidbilayers）中，破壞質(zhì)膜。其疏水部分與烴基結(jié)合，親水部分與水結(jié)合，因此可使脂質(zhì)和蛋白質(zhì)增溶（Solubilization）.幾種去污劑去污劑包括兩類：非離子型（nonionicdetergents）如TritonX-100、辛基葡萄糖離子型（ionicdetergents）如脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸納低濃度時，去污劑以游離形式存在于溶液中。隨著濃度的增加，它們聚合在一起，形成微團（micelles）.微團很小、圓球狀聚集物。其親水部分向外，疏水部分向內(nèi)。

臨界微團濃度（criticalmicelleconcentration，CMC）：去污劑開始形成微團時的濃度，為去污劑的特征常數(shù)離子型去污劑:除了能與膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合外，還能結(jié)合水溶性蛋白質(zhì)的疏水核心。由于它們帶電，所以能夠破壞蛋白質(zhì)中的鹽鍵和氫鍵,使蛋白質(zhì)變性。非離子型去污劑:比離子型溫和，不同濃度有不同作用方式高濃度（>CMC）時，與磷脂、膜蛋白一起形成微團.

低濃度（<CMC）時，雖然不形成微團，但仍能與大部分膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合，起增溶作用.大部分膜周邊蛋白（peripheralprotein）是可溶性。它們借離子鍵或其他弱鍵與特定的膜蛋白結(jié)合，因此可用高濃度的鹽或能與二價陽離子（如Ca2+）結(jié)合的試劑進行分離。開發(fā)既保持膜蛋白的天然結(jié)構(gòu)，又高產(chǎn)和高純度純化方法是人們的期待。（Novagen新開發(fā)TM-PEK:ProteoExtract膜蛋白抽提試劑盒）第二節(jié)蛋白質(zhì)的鑒定

一、分子量測定二、等電點測定三、末端氨基酸殘基測定四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈五、蛋白質(zhì)分子中的脂

一、分子量測定

１.滲透壓（osmoticpressure）２.沉降平衡（sedimentationequilibrium）３.凝膠過濾層析（gelfitrationchromatography）４.SDS５.激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（LDI-TOF-MS）1.滲透壓（osmoticpressure）同時測定幾個不同濃度的滲透壓，以π/c對c作圖并外推到蛋白質(zhì)濃度為零,得截距,從而求出M。為避免pH值的影響,在溶解度允許的范圍內(nèi),盡量采用等電點或接近等電點的緩沖液，并增加溶液中無機鹽的濃度。可以測分子量在1－10萬范圍的蛋白質(zhì)。實驗裝置簡單，準(zhǔn)確度高。但不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一。2.沉降平衡（sedimentationequilibrium）用較低的速度離心（8,000-20,000r/min）離心開始后，顆粒發(fā)生沉降，造成濃度梯度，同時產(chǎn)生擴散作用。擴散力與離心力作用方向相反，相互平衡公式：3.凝膠過濾層析（gelfitrationchromatography）公式：logM=K1-K2Ve

Ve：洗脫體積先測出幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve

，以它們的logM對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，即可從圖中確定蛋白質(zhì)的分子量.樣品可以是不純的。只要它具有專一的生物活性（或標(biāo)準(zhǔn)樣），借助活性找出洗脫峰位置，確定它的洗脫體積就能測定它的分子量.4.SDS公式：logM=K1-K2μR

以幾種標(biāo)準(zhǔn)單體蛋白質(zhì)分子量的logM對其μR值作圖，根據(jù)待測樣品的μR，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。SDS用以分析蛋白質(zhì)的分子量5.激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（laser

desorptionionization-timeofflight-mass

spectrometry,LDI-TOF-MS）高純度蛋白質(zhì)與有機酸混合，在靶金屬表面干燥.激光射線使蛋白質(zhì)離子化，離子經(jīng)加速后，飛入自由漂移區(qū)，最后到達檢測器。飛行時間與分子量成反比，與電量成正比?？蓽y定10-15-2×105的蛋白質(zhì)，誤差僅為0.0001。二、等電點測定溶解度法等電聚焦（IEF）

IEF原理IEF測pI三、末端氨基酸殘基測定用于未知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究和基因工程表達產(chǎn)物的末端分析N-terminus氨基酸殘基測定C-terminus氨基酸殘基測定

N-terminus氨基酸殘基測定化學(xué)法二硝基氟苯法（Sangerreaction）

（DNFB+肽→DNP-肽）丹磺酰氯法（DNS-Cl）異硫氰酸苯酯法（Edman降解法）（氨基末端→苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物）酶法氨肽酶法（aminopeptidase）氨基酸層析圖譜C-terminus氨基酸殘基測定

化學(xué)法

肼解法（hydrazinolysis）無水肼100℃處理，釋放C端aa

酶法羧肽酶法（carboxypeptidase）選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時間,得單個C端aa

四、蛋白質(zhì)分子中的糖鏈血球凝集反應(yīng)（植物凝結(jié)素）糖蛋白電泳（甲苯胺蘭、R山蘭、schiff試劑）糖組分分析（薄層層析、液相色譜、紅外分析）五、蛋白質(zhì)分子中的脂

蘇丹黑預(yù)染、電泳第三節(jié)蛋白質(zhì)的檢測一、抗體檢測二、WesternBlotting三、放射性同位素標(biāo)記法

一、抗體檢測

多抗（polyclonalantibodies,通常以抗血清的形式存在）是指不同種類抗體的混合物，能識別抗原分子中的多個抗原決定簇（epitopes）。單抗（monoclonalantibodies）指的是同種抗體，識別抗原分子中的特定抗原決定簇。單抗由一定數(shù)量的相同細胞產(chǎn)生。這些細胞來源于同一雜交瘤細胞（hybridoma;脾:瘤細胞融合）?？贵w可以檢測表面只相差一個殘基的蛋白質(zhì)。借助特殊的分析試劑可對蛋白質(zhì)進行精確定量或定位（免疫細胞化學(xué)、染色質(zhì)免疫共沉淀、WesternBlot

）。抗體檢測兩級抗體：一抗和二抗。一抗特異的與抗原結(jié)合，二抗除了與一抗結(jié)合外，還帶有檢測標(biāo)記。檢測標(biāo)記：如熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光、顯色基團及酶（如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶，催化無色物質(zhì)生成有色物質(zhì)）。ELISA-enzyme-linkedimmunosorbentassayELISAELISA結(jié)果二、WesternBlotting靈敏度高，用于檢測極微量的蛋白質(zhì)（Findaneedleinahastack.大海撈針）

與SDS、antibody、enzyme聯(lián)合使用WesternBlotting三、放射性同位素標(biāo)記法

放射性同位素的摻入不影響分子的性質(zhì)。選擇合適的同位素：根據(jù)實驗?zāi)康暮头派湫酝凰氐奶卣鳎ㄈ绨胨テ?、放射產(chǎn)生的能量及能否進入細胞等）進行選擇。放射自顯影：用感光材料進行感光，如X光膠片，液體乳膠。然后肉眼或顯微鏡觀察，可半定量。定量測定：用計數(shù)器（counter），如蓋革計數(shù)器（Geigercounter）、液閃計數(shù)器（scintillationcounter）。分析生物大分子在細胞內(nèi)的定位及運動。第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定二、已知序列肽鏈的人工合成三、蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定

－Edmam降解法（PTH法）

N末端氨基與苯異硫氰酸酯(PITC)在弱堿性條件下,形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲(PTH)－AA,而從肽鏈上降解,產(chǎn)物可用氣-液色譜法進行分離鑒定。

HPLC分析氨基酸二、已知序列肽鏈的人工合成人工合成肽：結(jié)構(gòu)分析、抗體制備、活性肽功能、新蛋白研究。

抗體制備：在動物體內(nèi)，10-15個殘基的小肽能刺激機體產(chǎn)生抗體。從而對蛋白質(zhì)進行分離、檢測及細胞內(nèi)定位。

新蛋白研究：分析末端AA,反推核苷酸,合成引物,PCR獲得基因或ORF,BLAST分析,同源性比對;蛋白質(zhì)特征及功能分析。tBOC:叔丁氧羰基，保護氨基酸氨基端.CF3COOH:三氟乙酸，去保護DCC:二環(huán)己基碳二亞胺，縮合劑HF:氫氟酸，把肽鏈從聚苯乙烯小株上斷裂下來掛接去保護縮合去保護斷裂肽鏈人工合成三、蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定1.X射線結(jié)晶（X-RayCrystallography）2.冷凍電鏡術(shù)（CryoelectronMic