豬卵透明帶3α重組乳桿菌疫苗的研發(fā)制造,免疫學(xué)論文

豬卵透明帶3α重組乳桿菌疫苗的研發(fā)制造,免疫學(xué)論文免疫避孕是一種生育期婦女節(jié)育的重要措施。常見的免疫避孕抗原有卵細(xì)胞外表抗原、精子外表抗原、人絨毛膜促性腺激素和生殖激素等，這些抗原可能干擾生育期婦女的生殖系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)，誘發(fā)生殖功能紊亂、免疫失調(diào)、本身免疫性疾病等疾病，因而尚需研究新型疫苗。乳桿菌〔Lactobacillus〕是一種革蘭陽性的無芽胞需氧菌，一般呈細(xì)長的桿狀，大小為〔0.5~1〕m〔2~10〕m.常成雙或短鏈狀排列。常見菌株有干酪乳桿菌〔L.casei〕、嗜酸乳桿菌〔L.acidophilus〕、植物乳桿菌〔L.plantarum〕和約氏乳桿菌〔L.johnsonii〕等，常用于食品和飼料加工業(yè)，在功能食品、醫(yī)療保健和微生態(tài)制劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，是一種極具開發(fā)價值的疫苗載體[1~3],本研究擬就乳桿菌介導(dǎo)的豬卵透明帶3抗原和人絨毛膜促性腺激素疫苗的構(gòu)建及其作用機(jī)制等方面的研制現(xiàn)在狀況進(jìn)行綜述。1大腸埃希菌-乳桿菌穿梭載體的構(gòu)建乳桿菌的細(xì)胞壁厚而且復(fù)雜，攝取外源DNA較為困難，Kim等[4]用電穿孔方式方法進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化乳桿菌的試驗，并探索出了較好的轉(zhuǎn)化條件，這為構(gòu)建重組乳桿菌疫苗提供了有利條件。為了將外源DNA有效引入乳桿菌，需構(gòu)建大腸埃希菌-乳桿菌穿梭表示出載體，乳桿菌的穿梭表示出載體通常有組成型和誘導(dǎo)型兩種類型。Guchte等[5]構(gòu)建的pMG36e是一種常見的組成型表示出載體。它含有p32啟動子及其下游部分的開放閱讀框、來自pUC18的多克隆位點和來自PrtP基因的轉(zhuǎn)錄終止子、pWV01的復(fù)制子和氯霉素抗性基因等。盡管該載體可表示出高水平的外源蛋白，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的富集和聚合卻可導(dǎo)致蛋白在胞質(zhì)中被降解，通常對細(xì)胞具有毒害作用。誘導(dǎo)型表示出載體可利用誘導(dǎo)劑對外源蛋白進(jìn)行可控性表示出，因此應(yīng)用較為廣泛。Ruyter等[6]開發(fā)了乳菌肽控制的表示出系統(tǒng)〔nisin-controlledexpressionsystem,NICE〕.該系統(tǒng)含有3個組分：攜帶nisR和nisK基因的宿主菌、充當(dāng)誘導(dǎo)分子的乳菌肽〔Nisin〕以及含有nisA啟動子的質(zhì)粒。誘導(dǎo)劑Nisin誘導(dǎo)ni-sA啟動子，nisA啟動子由nisR和nisK組成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。nisK是Nisin的膜結(jié)合感應(yīng)蛋白，nisR是膜內(nèi)反響調(diào)節(jié)子。nisK接受外源nisin肽信號后，本身磷酸化激活胞漿內(nèi)nisR,隨后nisR激活nisA啟動子，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄和表示出。宿主菌NZ3900含有nisK和nisR基因，質(zhì)粒pNZ8149含有nisA啟動子，其起始密碼子ATG處有NCOI酶切位點，這樣使插入的目的基因與nisA啟動子的核糖體結(jié)合位點區(qū)域構(gòu)成翻譯融合，較轉(zhuǎn)錄融合具有更高層次的表示出活性。通常將含有nisA啟動子的質(zhì)粒導(dǎo)入攜帶nisR和nisK蛋白的宿主菌時，外源基因的表示出較弱，當(dāng)在對數(shù)生長期參加nisin進(jìn)行誘導(dǎo)后，外源基因的表示出水平在一定范圍內(nèi)與nisin的劑量成正比，誘導(dǎo)效率能夠到達(dá)1000倍以上[7].乳桿菌的表示出載體既能夠利用胸苷酸合成酶〔thymidylatesynthase,Thy〕或丙氨酸消旋酶〔alanineracemase,Alr〕的營養(yǎng)缺陷型作為選擇標(biāo)記，可以以利用乳糖或木糖作為選擇標(biāo)記。這些標(biāo)記均可食用，對于口服疫苗的開發(fā)極具價值。人們發(fā)現(xiàn)thyA基因編碼的Thy在DNA合成中起關(guān)鍵作用，缺失thyA基因的菌株在普通培養(yǎng)基上不能生長，alr基因編碼的Alr是很多細(xì)菌生長的必需成分。Fu等[8]以干酪乳桿菌來源的thyA基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建了食品級載體pFXL103,Bron等[9]將含異源alr基因的質(zhì)粒pGIPO11轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌alr-菌株后，alr-菌株恢復(fù)了野生型表型。Platteeuw等[10]構(gòu)建了食品級穿梭表示出載體pLP3537,它含有l(wèi)acF選擇標(biāo)記、高拷貝內(nèi)源性的乳酸乳球菌pSH71復(fù)制子、lacA啟動子和PepN終止子，配套菌株為刪除了lacF基因的乳酸乳球菌NZ3900株，能夠利用乳糖作為選擇標(biāo)記。將pLP3537質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LacF基因缺失的宿主菌NZ3900株后，可使原來不能利用乳糖的宿主菌NZ3900發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸，使pH降低，使挑選培養(yǎng)基中的溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，這種利用乳糖為選擇標(biāo)記的表示出系統(tǒng)的元件都是食品級的，口服具有安全性。Gosalbes等[11]構(gòu)建了乳糖調(diào)節(jié)的乳酸桿菌食品級表示出載體pILac.戊糖乳球菌的MD353染色體上含有木糖〔xylose,xy1〕編碼基因，能夠發(fā)酵木糖。Posno等[12]把xy1基因插入pLP3537,得到食品級表示出載體pLP3537-xyl,能夠利用木糖作為選擇標(biāo)記，這些選擇標(biāo)記的成功開發(fā)為發(fā)展乳桿菌成為疫苗載體提供了有力的保障。2豬卵透明帶3重組乳桿菌疫苗豬卵透明帶3抗原〔porcinezonapellucid3，PZP3〕是一種分子量為73kDa的糖蛋白，包被于卵母細(xì)胞和著床前胚胎的外表，是一種精子特異性受體，在精卵結(jié)合和其后引發(fā)的精子頂體反響中起主要作用。Martinez等[13]將重組PZP3蛋白接種鼠猴獲得了較好的避孕效果，提示它是一種有效的受精前免疫避孕靶抗原。熊亞明等[14]以pVAX1-PZP3為模板擴(kuò)增900bp的PZP3編碼基因，插入pILac-SP得pILac-PZP3；將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，培養(yǎng)48h,免疫印漬發(fā)現(xiàn)兔抗PZP3的血清辨別重組菌表示出的分子量為55kDa的PZP3蛋白，表示清楚該疫苗可表示出具有生物活性的PZP3蛋白。3人絨毛膜促性腺激素重組乳桿菌疫苗3.1人絨毛膜促性腺激素人絨毛膜促性腺激素〔humanchorionicgonadotropinbeta-subunit,hCG〕是人體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的妊娠特有激素，可維持并刺激妊娠黃體產(chǎn)生孕酮，促進(jìn)蛻膜細(xì)胞發(fā)育成熟，是一種受精后免疫避孕的靶抗原。Talwar等[15]將hCG制劑接種受試婦女可誘導(dǎo)hCG抗體，一旦hCG抗體濃度到達(dá)50ng/mL的水平常即可誘導(dǎo)很好的避孕效果。Kahala等[16]發(fā)現(xiàn)短小乳桿菌的S-層蛋白A〔S-layerproteinA,SLPA〕是一種分子量為40kDa的信號蛋白，可有效引導(dǎo)外源蛋白在乳桿菌的分泌表示出。王紅梅等[17,18]以pBS-hCG為模板擴(kuò)增hCG編碼基因，與SLPA的編碼基因連接后，插入pILac得pILac-hCG；將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，0.5%乳糖誘導(dǎo)21h,SDS證實重組菌表示出分子量為22kDa的hCG蛋白；將108CFU疫苗經(jīng)陰道接種BALB/c鼠1次，在初次免疫后2周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的陰道沖洗液sIgA升高〔滴度1∶12800〕,提示該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一個有效的黏膜免疫應(yīng)答。姚曉英等[19~21]以短小乳桿菌的基因組DNA為模板擴(kuò)增90bp的SLPA編碼基因，以pBS-hCG為模板擴(kuò)增495bp的hCG編碼基因，將SLPA與hCG的編碼基因連接后插入pILac得pILac-hCG；將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，培養(yǎng)8h,免疫印漬發(fā)現(xiàn)兔抗hCG的血清辨別重組菌表示出的分子量為22kDa的hCG蛋白；將109CFU疫苗經(jīng)陰道注入BALB/c鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后5周發(fā)現(xiàn)陰道沖洗液sIgA升高，在初次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾細(xì)胞明顯增殖，并分泌高水平的IFN-和IL-4等細(xì)胞因子，放免試驗證實陰道沖洗液hCG水平在初次免疫后24~35d升高，在初次免疫后28d達(dá)較高水平〔濃度15MIU/mL〕;同時將1010CFU疫苗經(jīng)陰道接種和灌胃分別免疫BALB/c鼠和C57BL/6鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾細(xì)胞明顯增殖，在初次免疫后4~8周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的子宮和陰道沖洗液均存在IgG分泌細(xì)胞以及IgA分泌細(xì)胞，提示該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一個有效的黏膜和體液免疫應(yīng)答。3.2hCG-C3d3Dempsey等[22]以為補(bǔ)體片段C3d可增加靶抗原的免疫原性，C3d3是3個拷貝的C3d,與抗原共價結(jié)合后可選擇性加強(qiáng)宿主的體液免疫應(yīng)答。姚曉英等[23,24]以phCMV1-hCG-C3d3為模板擴(kuò)增hCG-C3d3的編碼基因，插入pILac得pI-Lac-hCG-C3d3;將其電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌CECT5276株，0.5%乳糖誘導(dǎo)24h,SDS證實重組菌表示出分子量為220kDa的hCG-C3d3融合蛋白；將1010CFU疫苗經(jīng)陰道分別接種BALB/c鼠和C57BL/6鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后2~8周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清和陰道沖洗液IgG和IgA升高，脾、子宮和陰道的淋巴細(xì)胞增殖，陰道和子宮的抗體分泌細(xì)胞的數(shù)目顯著增加，提示該疫苗同樣可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一個有效的黏膜和體液免疫應(yīng)答。El-Hefnawy等[25]發(fā)現(xiàn)MLTC-1細(xì)胞株是小鼠睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞系，可表示出hCG受體，在hCG刺激下可分泌孕酮。Wice等[26]證實Bewo細(xì)胞株是人絨癌細(xì)胞系，具有自發(fā)融合的生物學(xué)作用，可在體外模擬體內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化融合經(jīng)過。王健理等[27]將1010FU重組菌LL〔pILac-hCG-C3d3〕滴鼻免疫BALB/c鼠，在初次免疫后3周加強(qiáng)1次，在初次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清可抑制hCG刺激的MLTC-1細(xì)胞株分泌孕酮，抑制Bewo細(xì)胞株分泌hCG以及Bewo細(xì)胞株融合，提示該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生具有生物活性的hCG抗體。4結(jié)語乳桿菌具有下述優(yōu)點：它是一種發(fā)酵工業(yè)長期使用的食品級益生菌，是一種公以為安全〔generallyregardedassafe,GRAS〕的微生物，易培養(yǎng)，基因操作簡便可靠，轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好；乳桿菌是一種革蘭陽性菌，不分泌內(nèi)毒素，表示出的外源蛋白不需純化，可連同菌體直接服用；乳桿菌通常不產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白酶，不會在細(xì)胞外對分泌的外源蛋白進(jìn)行降解；乳桿菌通常較少分泌本身蛋白，減少了載體本身蛋白對分泌的外源蛋白的干擾；外源蛋白既可在細(xì)胞內(nèi)表示出，可以在細(xì)胞壁進(jìn)行表示出，還能夠分泌到細(xì)胞外進(jìn)行表示出；乳桿菌通常具有免疫佐劑、固有免疫原性和對膽汁酸的抵抗力，可在胃腸道定植，在胃腸道的微生態(tài)平衡中具有重要作用。乳桿菌與微顆粒疫苗的大小類似，可將抗原遞呈給腸黏膜組織的M細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；口服或滴鼻接種乳桿菌可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。乳桿菌具有下述缺點：當(dāng)前大部分乳桿菌表示出載體常含有非食品級的基因片段，這會給乳桿菌作為活菌微生態(tài)制劑帶來安全隱患；尚未說明乳桿菌疫苗誘導(dǎo)小腸產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制；尚未說明乳桿菌疫苗的表示出調(diào)控機(jī)制；長期口服乳桿菌疫苗并不能在宿主體內(nèi)表示出足量的抗原；長期低劑量口服乳桿菌疫苗有可能誘導(dǎo)免疫耐受；乳桿菌疫苗的效果評價僅限于體外試驗和動物試驗階段。隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步挑選高表示出能力的菌株可提高外源蛋白的表示出水平；針對不同的蛋白表示出方式采用不同的免疫途徑可提高重組乳桿菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；深切進(jìn)入研究乳桿菌分泌外源蛋白的調(diào)控機(jī)制；構(gòu)建安全高效的食品級表示出載體；準(zhǔn)確定位外源蛋白在乳桿菌中的表示出位置，使重組抗原與黏膜的免疫系統(tǒng)充分接觸；實時定量檢測重組乳桿菌在宿主胃腸道表示出的目的蛋白；合理控制重組乳桿菌在胃腸道的存活時間，避免免疫耐受；開發(fā)適宜的免疫佐劑加強(qiáng)重組乳桿菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。相信隨著這些問題的說明，將乳桿菌介導(dǎo)的免疫避孕疫苗用于生育期婦女的節(jié)育指日可待。以下為參考文獻(xiàn)[1]XUYi-gang,CUILi-chun.ProgressonLacticacidbacteriaasgeneengeneeringbacteria[J].ChinJMicrobiol,2007,19〔1〕:118-120.〔inChinese〕徐義剛，崔麗春。乳酸菌作為基因工程受體菌的研究瞻望[J]中