熒光定量PCR技術(shù)2010110生物科學-分子生物學

―qPCR系統(tǒng)“從RNA提取到熒光定量PCR”解決方案生物化學與分子生物學教研室內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法

熒光定量實驗流程及注意事項熒光定量應用及實例實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測熒光定量PCR原理－－定義熒光定量PCR原理－－常用名詞概念介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphase平臺期熒光基團熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴增曲線2.熒光定量標準曲線

Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphase

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）真正的信號:熒光信號超過域值，進入指數(shù)擴增期之后熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的最初階段Threshold熒光定量PCR原理－－熒光域值平臺期Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值同一個樣品重復96次PCR的擴增曲線

熒光定量PCR原理－－PCRvsqPCRCt值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性理想的PCR反應Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學原理非理想的PCR反應Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)En：擴增效率熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學原理在擴增產(chǎn)物達到熒光閾值時，所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為CtXCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：在閾值設(shè)定以后，XCt是一個常數(shù)，可以用熒光強度表示的產(chǎn)物量，定為M方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：LogM＝LogX0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學原理CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

起始模板量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系確定未知樣品的C(t)值通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample25線性關(guān)系、擴增效率確認檢測靈敏度確認標準曲線斜率:-3－-3.535Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果（科研領(lǐng)域）如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98熒光定量PCR反應有效性的確認PCR擴增效率（E）:0.9-1.2

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，

GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達量分析，siRNA效果確認，基因芯

片結(jié)果驗證，差異顯示結(jié)果驗證等熒光定量PCR技術(shù)的應用內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南非特異性熒光標記

SYBRGreenI特異性熒光標記

TaqManProbe分子信標常用熒光標記方法SYBRGreenI染料法——原理

SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI熱變性引物退火延伸反應SYBRGreenI染料法——作用機理

SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復性和延伸時，形成雙鏈DNA，

SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen

SYBRGreenI染料法——作用機理CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)-dIdTTmSingleamplifiedproduct溶解曲線檢測引物特異性MeltcurveshowingtwoamplifiedproductsSYBRGreen法------PCR反應的建立反應體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應Buffer體系的優(yōu)化反應溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同SYBRGreen法應用范圍

起始模板的測定融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應的條件，對常規(guī)PCR有指導意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。SYBRGreen法優(yōu)缺點

對DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

-----不必設(shè)計復雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應條件對引物特異性要求較高缺點問題點：

SYBRGreenI與任何雙鏈DNA進行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時被檢測，從而可能導致檢測結(jié)果不準確。SYBRGreenI染料法——問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵點：

設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增！Taqman探針法——原理

5′端標記有報告基團(Reporter,R)3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物RRRR每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光1、引物、探針的設(shè)計原則：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<200bp，引物Tm為59-60℃2、反應參數(shù)的設(shè)定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：100-900nM探針濃度：50-300nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立TaqMan法優(yōu)缺點

對目標序列的高特異性

------陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單

------與目標序列某一區(qū)域互補重復性比較好優(yōu)點

只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點實時熒光定量PCR的分類－－幾種方法的比較方法優(yōu)點缺點適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復性好價格高只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核,遺傳疾病的診斷Molecularbeacon法(分子信標)——原理標記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針Molecularbeacon(分子信標)工作原理

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針與DNA雜交時產(chǎn)生熒光

-----變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光

-----延伸過程：不產(chǎn)生熒光

------退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號Molecularbeacon(分子信標)應用范圍

起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析Molecularbeacon(分子信標)優(yōu)缺點高特異性：對目標序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點

只能用于一個特定目標設(shè)計困難價格比較高缺點內(nèi)容概要

熒光定量PCR原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南熒光定量PCR的解析方法（依據(jù)課題要求提前確定）絕對定量解析方法相對定量解析方法絕對定量解析方法Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品,可作出標準曲線,即得到該擴增反應存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量質(zhì)粒標準品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標準品使用目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×50×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014

倍比梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v質(zhì)粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計算實時熒光定量PCR法絕對定量方法方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）

標準品：質(zhì)粒標準品濃度為106、105

、104

、103

；2個重復；設(shè)陰性空白對照

實驗步驟：提取HBVDNA；

設(shè)計特異引物；設(shè)計TaqMan探針并標記探針；熒光定量擴增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標準品5×10328.1828.6428.410.16標準品5×10425.2525.1425.190.04標準品5×10522.1122.4622.280.12標準品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數(shù)據(jù)絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量擴增效率（E）計算E=10-1/斜率

－1=10-1/-3.29

－1

=2.01－1=1.01標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線y=-3.29x+40.33R2=0.9978絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴增效率（E）：0.9-1.2,越接近1，越理想。

未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03

=1,071,519copies絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-40.33-3.29=6.03相對定量解析方法理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數(shù)相同實際目的基因表達量分析相對定量的必要性必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行校正，進行相對表達量分析。管家基因

維持細胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

實時熒光定量PCR法TaqMan法舉例TaqMan法研究ERBB2在乳腺腫瘤組織標本中的表達差異TaqMan法舉例標記探針使用TaqMan探針進行雙通道熒光定量

Fam標記目標基因探針VIC標記看家基因探針TaqMan法舉例材料準備從正常乳腺組織中提取的總RNA從乳腺癌組織中提取的總RNA含ERBB2andGAPDH的質(zhì)粒用于生成標準曲線單雙通道同時進行，獨立分析

ControlsnoRNA：陰性對照RNA+noreversetranscriptase：基因組對照TaqMan法舉例癌癥標記物表達Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2TaqMan法舉例實驗結(jié)果定量Copiesng/μlTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45XTaqMan法舉例實驗結(jié)果定量分析ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/μlTotalRNATaqMan法舉例實驗結(jié)果表達差異HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表達差異TaqMan法舉例實驗結(jié)果討論通過RT-qPCR成功檢測了ERBB2基因在不同組織的表達差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達量是正常水平的1.8倍雙標準曲線法

2-△△Ct法(CT值比較法)

相對定量分析——兩種常用的分析方法

通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。

相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標準曲線法公式：優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線應用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一相對定量分析——雙標準曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實驗數(shù)據(jù)公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)點：無需作標準曲線缺點：假定擴增效率接近100%；假定標準曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致；應用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值－－－－△△Ct｛｝實驗數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.40.950.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在處理后表達水平是處理前的5.3倍修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于1，那么2－△△Ct可以修正為：（1＋E）－△△Ct，例如擴增效率為0.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析——2-△△Ct法內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品熒光定量PCR儀的硬件條件激發(fā)光源熱循環(huán)－加熱、制冷樣品檢測設(shè)備SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備定量體系配備引物設(shè)計反應條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機反應體系優(yōu)化試劑選擇分析方法RNA制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機質(zhì)量確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計檢測電泳檢測RT反應體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析上機AMVM-MLVQuant下游反應數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項定量體系配備引物設(shè)計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機核酸制備區(qū)反應液制備區(qū)制作標準曲線設(shè)定濃度區(qū)間使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復（≥3次）設(shè)置空白和