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分子生物學(xué)討論P(yáng)ART11.DNA提取的原理和方法2.限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理和方法3.DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和分析及其應(yīng)人類基因組DNA提取主要內(nèi)容1、基因組DNA2、質(zhì)粒DNA3、細(xì)胞器DNA
CTAB法
SDS法其它方法堿裂解法煮沸法差速離心法基因組DNA
CTAB法CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜,并與核酸形成復(fù)合物。具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在這種條件下,蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里該復(fù)合物在高鹽溶液中(>0.7mol/LNaCl)是可溶的,通過有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞;EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境,使DNP(脫氧核糖核蛋白)。CTAB溶解細(xì)胞膜,并結(jié)合核酸,使核酸便于分離;β-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除CTAB法流程圖SDS法SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑,在高溫(55~65℃)條件下能裂解細(xì)胞,使染色體離析,蛋白變性,釋放出核酸;提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度(冰浴),使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀,離心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法DNA提取緩沖液
SDS法流程圖(以動(dòng)物組織為例)其它方法濃鹽法:利用RNA和DNA在鹽溶液中溶解度不同,將二者分離
有機(jī)溶劑抽提法:有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制核酸酶的降解作用
密度梯度離心法:利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物質(zhì)粒DNA堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多,且染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子;當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí),線狀染色體DNA容易發(fā)生變性,共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象;變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,從而可通過離心將兩者分開。煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多,且染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子;當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí),線狀染色體DNA容易發(fā)生變性,共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象;變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,從而可通過離心將兩者分開。細(xì)胞器DNA差速離心法線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器,自身可編碼蛋白,它們的比重和大小一定,因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定,根據(jù)這一原理,常用不同轉(zhuǎn)速的離心法,將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來。差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)(蔗糖)中,以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心,比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降,比重小的卻處于上層,從而得以分離。DNA提取的基本步驟材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離、純化核酸沉淀、溶解End限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1.限制性核酸內(nèi)切酶:
---是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來的。根據(jù)1994年美國(guó)出版的《分子生物學(xué)百科全書》的統(tǒng)計(jì)數(shù)字,僅Ⅱ型核酸內(nèi)切限制酶一項(xiàng)迄今就已從各種不同的微生物當(dāng)中,分離出2300種以上,可識(shí)別230種不同的DNA序列。2、發(fā)現(xiàn)早在20世紀(jì)中期,以Arber等人對(duì)入噬菌體在大腸桿菌不同菌株的平板培養(yǎng)效應(yīng)的研究中,就發(fā)現(xiàn)了原核生物體內(nèi)存在著寄主控制的限制(Restriction)和修飾(Modification)系統(tǒng)(R-M系統(tǒng))。二、概念核酸酶:催化核酸酯鍵的水解核酸外切酶:作用于核酸鏈的末端(3’端或5’端)逐個(gè)水解下核苷酸核酸內(nèi)切酶:從核酸分子內(nèi)部切斷3’,5’-磷酸二酯鍵限制性核酸內(nèi)切酶:在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)存在的一類能識(shí)別并水解外源雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶三、限制性核酸內(nèi)切酶的分類1、第一型(TypeI):既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;2、第二型(TypeII):只催化非甲基化的DNA的水解,其切割位
點(diǎn)可知、固定是,是最常用的限制性核酸內(nèi)切酶;3、第三型(TypeIII):同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用徐師大-屈艾老師制作28四.核酸內(nèi)切限制酶的類型特性(7項(xiàng))I型II型III型限制和修飾活性單一多功能的酶分開的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶具有一種共同亞基的雙功能的酶核酸內(nèi)切限制酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單鏈多肽2種不同的亞基徐師大-屈艾老師制作29五、Ⅱ型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性1.為單鏈多肽,最適pH6-8,能被鹽抑制、被Mg2+激活;2.底物DNA分子雙鏈中有特異性識(shí)別序列
通常有4-8個(gè)bP甚或更多,大都為一回文對(duì)稱的結(jié)構(gòu)(即識(shí)
別序列)3.一般可在特異性識(shí)別序列內(nèi)切割雙鏈DNA分子(有例外),產(chǎn)生鏈的斷裂,斷裂端有粘性末端和平齊末端之分。
c徐師大-屈艾老師制作30
表:幾種常見的限制性核酸內(nèi)切酶徐師大-屈艾老師制作31六、識(shí)別序列識(shí)別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列?;匚男蛄械母拍睿壕哂刑禺愋宰R(shí)別的反向重復(fù)序列稱為回文序列。識(shí)別序列有連續(xù)的(如GATC)和間斷的(如GANTC)兩種,它們都呈回文結(jié)構(gòu)。徐師大-屈艾老師制作32
七、
切割類型檢驗(yàn)大量的實(shí)驗(yàn)事例之后發(fā)現(xiàn),由核酸內(nèi)切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割類型,通常是屬于下述兩種排列方式之一:(1)兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列,這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段(3’-和5’-
);(2)兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心,這樣形式的斷裂是形成具有平齊末端的DNA片段。八、末端粘性末端:當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí),產(chǎn)生的就是黏性末端意義:
1、便于連接:只要粘性末端互補(bǔ)就可以連接;2、5’端標(biāo)記:凸出的5’末端可以用DNA多核苷酸激酶進(jìn)32P標(biāo)記。凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶
添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等)
造成人工粘性末端;
3、補(bǔ)平成平齊末端:在DNA聚合酶的作用下補(bǔ)齊末端平末端:而當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí),產(chǎn)生的則是平末端徐師大-屈艾老師制作36
九、產(chǎn)生的末端特征
我們所說的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)(若是-3),它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新連結(jié)起來。
平末端的DNA片段與粘性末端相比,則不易于重新連結(jié),耗能多。有些限制性酶(約10種,如BbVⅠ等),其識(shí)別序列不表現(xiàn)為回文結(jié)構(gòu),它們降解雙鏈DNA時(shí),酶切點(diǎn)大部分不在識(shí)別序列內(nèi),而是與識(shí)別序列相距5至13個(gè)核苷酸殘基不等徐師大-屈艾老師制作38十.影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素(5點(diǎn)+1)
DNA的純度DNA的甲基化程度酶切消化反應(yīng)的溫度DNA的分子結(jié)構(gòu)
核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液
關(guān)于限制性內(nèi)切酶的星活性徐師大-屈艾老師制作391、DNA的純度核酸內(nèi)切限制酶消化DNA底物的反應(yīng)效率,在很大程度上是取決于所使用的DNA本身的純度。若污染了在DNA制劑中的某些物質(zhì)后例如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸鈉、以及高濃度的鹽離子等都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性。徐師大-屈艾老師制作40
為了提高核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度DNA的反應(yīng)效率,一般采用如下三種方法:①增加核酸內(nèi)切限制酶的用量,平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些。(加大成本)②擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積,以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋。③延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。
41在有些DNA制劑中(尤其是按微量堿法制備的)會(huì)含有少量的Dnase(活性需要有Mg2+的存在)的污染。而在DNA的貯存緩沖液中含有螯合二價(jià)金屬離子的EDTA,因此在這種貯存制劑中的DNA仍然是穩(wěn)定的。然而在加入了核酸內(nèi)切限制酶緩沖液之后(內(nèi)含Mg2+),DNA則會(huì)被DNase迅速地降解掉。要避免發(fā)生這種情況,唯一的辦法就是使用高純度的DNA。徐師大-屈艾老師制作42
2、DNA的甲基化程度
限制性核酸內(nèi)切酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分,因此識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化作用,會(huì)強(qiáng)烈地影響酶的活性。
為避免產(chǎn)生這樣的問題,在基因克隆中使用的是從失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備的質(zhì)粒DNA。
徐師大-屈艾老師制作43
3、酶切消化反應(yīng)的溫度
不同的核酸內(nèi)切限制酶,具有不同的最適反應(yīng)溫度,而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃,但也有許多例外的情況。其中有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度低于標(biāo)準(zhǔn)的37℃例如SmaI是25℃、ApaI是30℃;有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度則高于標(biāo)準(zhǔn)的37℃,例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃;還有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度可高達(dá)60℃以上。消化反應(yīng)的溫度低于或高于最適溫度,都會(huì)影響核酸內(nèi)切限制酶的活性,甚至最終導(dǎo)致完全失活。徐師大-屈艾老師制作44
4、DNA的分子結(jié)構(gòu)
DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量,要比消化線性DNA的高出許多倍,最高的可達(dá)20倍。此外,還有一些核酸內(nèi)切限制酶,切割它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn),其效率亦有明顯的差別。據(jù)推測(cè),這很可能是由于側(cè)翼序列的核苷酸成份的差異造成的。
徐師大-屈艾老師制作45
5、限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液
核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括:
氯化鎂或醋酸鎂,氯化納或醋酸鉀Tris-HCl(-AC),?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)牛血清白蛋白(BSA)酶活性的正常發(fā)揮,是絕對(duì)需要二價(jià)陽離子的,通常是Mg2+。購(gòu)買時(shí)廠家會(huì)提供專門的緩沖液并有說明其成分。有些核酸內(nèi)切酶可以在2種甚至4種緩沖液中均有較高的催化活性。
對(duì)絕大多數(shù)限制酶來說,在pH=7.4的條件下,其功能
最佳,一般為pH6—8。徐師大-屈艾老師制作46
6.星活性在“非最適的”反應(yīng)條件下(包括高濃度的核酸內(nèi)切限制酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”,從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子,這種現(xiàn)象稱為Star活性。
有些核酸內(nèi)切限制酶的切割特異性,受所用的緩沖液成份的影響比較明顯。例:EcoRI限制酶,在正常的情況下,是在G↓AATTC識(shí)別序列處發(fā)生切割作用的,但如果緩沖液中的甘油濃度超過5%(體積分?jǐn)?shù)),那么其識(shí)別序列的特異性就會(huì)發(fā)生松動(dòng),可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用。EcoRI限制酶的這種特殊的識(shí)別能力,通常叫做星活性,以EcoRI*表示。徐師大-屈艾老師制作47七、限制酶消化反應(yīng)的步驟例:0.2—1.0ugDNA進(jìn)行消化的典型反應(yīng)步驟如要對(duì)更大量的DNA進(jìn)行消化,則反應(yīng)的各個(gè)成分須相應(yīng)放大。將DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻,使總體積為18ul。加入2ul適當(dāng)?shù)?0X限制酶消化緩沖液。輕敲管外壁以混勻之。加入1—2單位限制酶,輕彈管外壁以混勻之。徐師大-屈艾老師制作48將上述混合的反應(yīng)物置于適當(dāng)溫度并按所需的時(shí)間進(jìn)行溫育。加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)使終濃度達(dá)10mmol/L,以終止反應(yīng)。如果消化后DNA直接進(jìn)行凝膠電泳分析,可加入6ul凝膠電泳加樣緩沖液,振蕩混合后,即可加樣進(jìn)行電泳。純化消化后的DNA,可用酚:氯仿和氯仿各抽提1次,再用乙醇沉淀DNA。徐師大-屈艾老師制作49
六.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止
消化DNA樣品后,在進(jìn)一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性,大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的鈍化方法是65℃溫浴5分鐘。但有些酶,如BamHI和HaeⅡ?qū)岱€(wěn)定,則需加入終止反應(yīng)液(如加入0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的終濃度達(dá)到10mmol/L)?以終止反應(yīng)。此外,還可以用等體積的酚抽提酶解產(chǎn)物,提取DNA。如果用限制性內(nèi)切酶消化DNA分子后,為了進(jìn)行凝膠電泳分析,則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液,振蕩混合后,直接上樣進(jìn)行凝膠電泳。徐師大-屈艾老師制作50八.使用限制酶的注意點(diǎn)(4點(diǎn))1、限制酶十分昂貴!遵循以下建議可以最大限度地節(jié)省開支。為能從貯存管內(nèi)取出小量的酶,只要用一次性使用的移液器吸頭在酶溶液表面輕沾一下即可。這樣,你可以取到至少0.1ul的酶量。濃縮的限制酶也可在使用前用1X限制酶緩沖液稀釋。但切勿用水稀釋以免酶變性。徐師大-屈艾老師制作513、盡量減少反應(yīng)中的加水量以使反應(yīng)體積減到最小。但要確保酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10,否則,限制酶活性將受到甘油的抑制。4、
通常延長(zhǎng)消化時(shí)間可使所需的酶量減少。這在切割大量DNA時(shí)不失為一大節(jié)約方法。在消化過程中,可取少量反應(yīng)液進(jìn)行微膠電泳以判斷消化進(jìn)程。瓊脂糖凝膠電泳(DNA)主要內(nèi)容常見問題與解決辦法相關(guān)概念實(shí)驗(yàn)方法凝膠電泳
當(dāng)一種分子被放置在電場(chǎng)當(dāng)中時(shí),它們就以一定速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O,這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度,叫做電泳的遷移率,它同電場(chǎng)的強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。在電泳中使用一種無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì),可使對(duì)流運(yùn)動(dòng)降低,故電泳的遷移率與分子摩擦系數(shù)成反比。因此根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)成或形狀的差異,以及所帶的凈電荷的多少,便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。
生理?xiàng)l件下,核酸分子的糖—磷酸骨架中的磷酸基因呈離子狀態(tài),因此,當(dāng)核酸分子被放置在電場(chǎng)中時(shí),它們就會(huì)向正電極的方向遷移。由于糖—磷酸骨架結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì),相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因而它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下,DNA分子的這種遷移速度,亦即電泳的遷移率,取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型,分子量較小的DNA分子比分子量較大的DNA分子遷移要快些。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。瓊脂糖凝膠
瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力,大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量,而且還取決于分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質(zhì)太大,對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì),相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。決定因素
DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
瓊脂糖濃度一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。決定因素
DNA分子的構(gòu)象
DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而開環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
電源電壓在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加,不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng),片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。
嵌入染料的存在熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15%。
離子強(qiáng)度影響電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。對(duì)于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)器械實(shí)驗(yàn)方法試劑配制
1.5×TBE緩沖液:450mmol/LTris-硼酸,10mmol/LEDTA,pH值8.0。使用時(shí)將上述儲(chǔ)存液稀釋10倍至0.5×TBE緩沖液,可同時(shí)作為電泳及制膠用的緩沖液。制膠1.根椐制膠量及凝膠濃度,在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中,加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉(總液體量不宜超過錐瓶的50%)。瓊脂糖粉末與0.5×TBEbuffer的比例參考下表,常用瓊脂糖濃度為0.7-1%。瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍實(shí)驗(yàn)方法—制膠1.在錐瓶的瓶口上蓋上保鮮膜或牛皮紙,并在膜或紙上扎些小孔,然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時(shí),當(dāng)溶液沸騰后,請(qǐng)戴上防熱手套,小心搖動(dòng)錐瓶,使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復(fù)數(shù)次,直至瓊脂糖完全溶解。2.使溶液冷卻至50℃-60℃左右,如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠溶液(終濃度0.5μg/ml)或按照1μL/30mL的比例加入DNAgreen染料,并充分混勻。3.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中,然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5mm之間。制膠模如下圖所示,小膠倒入25-30mL左右瓊脂糖溶液,大膠則60-70mL左右,若需切膠回收,凝膠可適當(dāng)加厚。4.在室溫下使膠凝固,大約30分鐘~1小時(shí)。實(shí)驗(yàn)方法—上樣1.取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻(如:1μl樣品與5μl6×上樣緩沖液),用微量移液槍小心加入樣品槽中。2.上樣量根據(jù)樣品濃度可適當(dāng)調(diào)整,若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量(一般小孔40μl為上限,大孔200μl為上限,具體和制膠膜規(guī)格相關(guān))。3.每加完一個(gè)樣品要更換槍頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。實(shí)驗(yàn)方法——電泳1.加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源??刂齐妷罕3衷?10V,電流在40mA以上。2.當(dāng)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)(約40min),停止電泳。3.紫外下拍照并觀察。注意事項(xiàng)1.5×TBE緩沖液放置時(shí)間過久會(huì)沉淀,因此一次性不要配太多。工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液,取5×TBE緩沖液貯存液稀釋,現(xiàn)配現(xiàn)用。2.用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統(tǒng)一。3.瓊脂糖粉在微波爐中加熱時(shí)間不宜過長(zhǎng),每次當(dāng)溶液起泡沸騰時(shí)停止加熱,否則會(huì)引起溶液過熱暴沸,造成瓊脂糖凝膠濃度不準(zhǔn),也會(huì)損壞微波爐。溶解瓊脂糖時(shí),必須保證瓊脂糖充分完全溶解,否則,會(huì)造成電泳圖像模糊不清。4.凝膠不立即使用時(shí),用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天。結(jié)果圖常見問題與解決辦法凝膠制備1.微波爐溶解瓊脂糖時(shí),膠液沸騰沖溢出三角錐瓶微波爐加熱時(shí)膠液可能發(fā)生劇烈沸騰,
1)總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量
2)2%以上膠液設(shè)置中火加熱
3)膠液劇烈沸騰時(shí),停止加熱,移開三角錐瓶,請(qǐng)戴上防熱手套,小心搖動(dòng)三角錐瓶,然后再次加熱,膠液沸騰直至膠清澈,保證瓊脂糖完全溶解。2.瓊脂糖電泳圖像背景模糊不清瓊脂糖沒有完全溶解會(huì)造成電泳圖像背景模糊不清。完全溶解的瓊脂糖膠液清澈,三角錐瓶?jī)?nèi)壁應(yīng)沒有粘附瓊脂糖顆粒。3.加熱后水分蒸發(fā),如需要應(yīng)加入熱的蒸餾水,補(bǔ)足到原來的重量,搖勻。電泳1.DNA條帶模糊,拖尾DNA降解。避免核酸酶污染。DNA上樣量過多。減少凝膠中DNA上樣量。電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后,離子強(qiáng)度降低,pH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm,溫度<30℃,巨大DNA鏈,溫度應(yīng)<15℃,核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。DNA樣含鹽過高。泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。有蛋白污染。電泳前抽提去除蛋白。DNA變性。電泳前勿加熱,用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。2.DNA條帶淡弱或無DNA帶DNA的上樣量不夠:增加DNA的上樣量。DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。DNA走出凝膠:縮短電泳時(shí)間,降低電壓,增強(qiáng)凝膠濃度。分子大小相近的DNA帶不易分辨。增加電泳時(shí)間,使用正確的凝膠濃度。DNA變性:電泳前請(qǐng)勿高溫加熱DNA鏈,用10mmNaClBuffer稀釋DNA。DNA鏈巨大,常規(guī)凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上分析。3.DNAMARKER條帶扭曲配制凝膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時(shí)配制的。使用同時(shí)配制的緩沖液。電泳時(shí)緩沖液高過液面1-2mm即可。電泳時(shí)電壓過高??梢栽陔娪厩?5分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔后,再調(diào)電壓。盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。EndPART21.RNA提取的原理和方法2.RT-PCR的原理和方法3.RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和分析及其應(yīng)用RNA提取的原理和方法主要內(nèi)容RNA分類目的難點(diǎn)1.原理2.方法提取流程兩條途經(jīng)知識(shí)拓展RNA提取的原理rRNA(80-85%)
tRNA、核內(nèi)小分子RNA(10-15%)mRNA(1-5%)真核細(xì)胞質(zhì)總RNA人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取原理返回分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物分離提純RNA的目的返回核糖殘基的2'和3'位置帶有羥基,RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富,加熱后仍能正確折疊恢復(fù)活性,不易失活需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性分離主要難點(diǎn)——RNA的不穩(wěn)定性返回RNA提取的方法實(shí)驗(yàn)室酵母RNA的提取1.RNA的提取2.RNA的離心分離3.RNA的純化2、方法及原理RNA的提取流程
1、樣本前處理
2、細(xì)胞裂解——?jiǎng)驖{器
3、RNA的純化及獲得樣本的選擇樣本的保存樣品的選擇
選擇新鮮血液,不得超過4小時(shí)選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長(zhǎng)旺盛的時(shí)期收集細(xì)胞選擇新鮮組織,生長(zhǎng)旺盛的組織許多植物組織中富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會(huì)隨著植物的生長(zhǎng)而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。在植物材料勻漿時(shí),酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來,氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚?,并隨氧化程度的增加而加深,這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)。被氧化的酚類化合物(如醌類)能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合,從而影響RNA的分離純化??蓪⑿迈r血液先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解,得到的白細(xì)胞然后加入一定量的TRNzol,-70℃保存較長(zhǎng)時(shí)間去掉培養(yǎng)基,加入一定量TRNzol-70℃保存較長(zhǎng)時(shí)間推薦使用專門的RNA樣品儲(chǔ)存液進(jìn)行儲(chǔ)存液氮或加入RNase抑制劑中保存,避免反復(fù)凍融樣品的保存返回勻漿器:用于使樣品均勻化的裝置,可使組織、細(xì)胞或細(xì)胞組分等破裂分散成小顆粒,成為比較均勻的懸浮液。常由精細(xì)加工的研棒、管子和電動(dòng)攪拌器構(gòu)成。返回
1.有效地使核蛋白復(fù)合體變性;
2.對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制;(最關(guān)鍵)
3.有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離;
4.對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。RNA的提取的要點(diǎn)89焦碳酸二乙酯(DEPC):是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。異硫氰酸胍(TRIzol法)
:目前被認(rèn)為最有效的RNA酶抑制劑。裂解組織同時(shí)使RNA酶失活常用的RNA酶抑制劑氧釩核糖核苷復(fù)合物:由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物。和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能完全抑制酶的活性。
其他:SDS、尿素、硅藻土RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):大鼠肝或人胎盤中提取得來。酸性糖蛋白。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑??梢院投喾NRNA酶結(jié)合,使其失活。返回RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑1),提取總核酸,然后直接在酸性條件下抽提,酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。2),提取總核酸,再用氯化鋰將RNA沉淀出來;第二種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失,目前該方法的使用頻率已很低。方法一:總RNA的試劑盒快速提取
——TRIzol法
TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑,可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍(常用的RNA酶抑制劑)等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。且是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、適合大量樣本的RNA提取方法
1.TRIzol法1)細(xì)胞裂解:用TRIZOL試劑直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA2)流程簡(jiǎn)述:提取液加酚氯仿水樣層(含RNA)和有機(jī)層(含蛋白和DNA)收集水樣層
RNA沉淀
純化的RNARNA離心異丙醇②乙醇、離心、去上清基因組DNA水相有機(jī)相RNA氯仿純化pH5.7離心加入裂解液(TRNzol-A+)離心、棄上清①離心、棄上清晾干(不完全)適量DEPC水溶解TRIzol法提取流程操作步驟1.樣品處理組織:50-100mg組織中加入1mlTROzlo試劑。單層細(xì)胞:加入TROzlo試劑1ml/cm2平板。懸浮細(xì)胞:處理前洗滌細(xì)胞,以防止RNA降解。每5-10×105動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞,或1×107細(xì)菌加入1mlTROzlo試劑。2.將上述樣品于15-30℃靜置5min,使核蛋白充分解離。3.加入0.2ml(1mlTROzlo試劑)氯仿,蓋緊蓋子,充分劇烈振蕩15s并于15-30℃靜置2-3min。4.于2-8℃12000g離心15min。離心后樣品分層,上層水相中含RNA,下層有機(jī)相中含蛋白和DNA。5.取上清,加入0.5ml異丙醇,輕輕混勻,于15-30℃靜置10min后,在管底會(huì)出現(xiàn)膠狀沉淀,即為RNA。6.于2-8℃12000g離心10min后棄去上清。7.向沉淀中加入1ml75%乙醇,輕輕混勻。8.于2-8℃7500g離心5min后棄上清9.將RNA樣品涼干(不要徹底干燥),加入適量DEPC水溶解(可于55-60℃促溶10min)。方法二:氯化鋰法提取總RNA本方法用高濃度尿素來使蛋白變性和抑制RNA酶,用氯化鋰選擇沉淀RNA,其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA
,具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。1:對(duì)于大量組織或細(xì)胞,則每克組織或細(xì)胞加入5-10ml氯化鋰-尿素溶液,勻槳器高速勻槳2分鐘;對(duì)于少量細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞/ml),則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰-尿素溶液手工勻槳,并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中2:勻槳液在0-4℃放置4小時(shí)后,12000g離心30分鐘3:取沉淀,加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液,重復(fù)步驟24:沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液復(fù)溶后,加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15-30分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻,4000g離心5分鐘5:取上層水相,加1/10倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2)及2倍體積的乙醇,-20℃放置1小時(shí),5000g離心。6:70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7:RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分裝,于-70℃保存。返回
擴(kuò)展:RT-PCR100RT-PCR原理原理是:提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、OligodT及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,三種都可。逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR)或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR),是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形??俁NA的提取cDNA第一鏈的合成PCRRT-PCR方法1.在0.5ml微量離心管中,加入總RNA1-5μg,補(bǔ)充適DEPCH2O使總體
積達(dá)11μl。在管中加10μMOligo(dT)12-181μl,輕輕混勻、
離心。
2.70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。然后加入
下列試劑的混合物:10×PCRbuffer2μl,25mMMgCl22μl,
10mMdNTPmix1μl,0.1MDTT2μl
輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5min。
3.加入SuperscriptⅡ1μl,在42℃水浴中孵育50min。
4.于70℃加熱15min以終止反應(yīng)。
5.將管插入冰中,加入RNaseH1μl,37℃孵育20min,降解殘留的
RNA。
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