DNA,RNA提取原理方法和瓊脂糖凝膠電泳,PCR技術,限制性內切酶簡介

分子生物學討論PART11.DNA提取的原理和方法2.限制性核酸內切酶切割的原理和方法3.DNA瓊脂糖凝膠電泳結果和分析及其應人類基因組DNA提取主要內容1、基因組DNA2、質粒DNA3、細胞器DNA

CTAB法

SDS法其它方法堿裂解法煮沸法差速離心法基因組DNA

CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里該復合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB提取緩沖液的經典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白）。CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除CTAB法流程圖SDS法SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法DNA提取緩沖液

SDS法流程圖（以動物組織為例）其它方法濃鹽法：利用RNA和DNA在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離

有機溶劑抽提法：有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用

密度梯度離心法：利用不同內容物密度不同的原理分離各種內容物質粒DNA堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在冷卻時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。細胞器DNA差速離心法線粒體和葉綠體是生物體內半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內的沉降速度也一定，根據這一原理，常用不同轉速的離心法，將細胞內各種組分分級分離出來。差速離心法原理是利用物質比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質置于均勻介質（蔗糖）中，以一定的轉速進行離心，比重大的物質優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。DNA提取的基本步驟材料準備細胞裂解核酸分離、純化核酸沉淀、溶解End限制性核酸內切酶一、限制性內切酶的發(fā)現1．限制性核酸內切酶：

---是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來的。根據1994年美國出版的《分子生物學百科全書》的統(tǒng)計數字，僅Ⅱ型核酸內切限制酶一項迄今就已從各種不同的微生物當中，分離出2300種以上，可識別230種不同的DNA序列。2、發(fā)現早在20世紀中期，以Arber等人對入噬菌體在大腸桿菌不同菌株的平板培養(yǎng)效應的研究中，就發(fā)現了原核生物體內存在著寄主控制的限制(Restriction)和修飾(Modification)系統(tǒng)（R-M系統(tǒng)）。二、概念核酸酶：催化核酸酯鍵的水解核酸外切酶：作用于核酸鏈的末端（3’端或5’端）逐個水解下核苷酸核酸內切酶：從核酸分子內部切斷3’,5’-磷酸二酯鍵限制性核酸內切酶：在細菌細胞內存在的一類能識別并水解外源雙鏈DNA的核酸內切酶三、限制性核酸內切酶的分類1、第一型（TypeI）：既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；2、第二型（TypeII）：只催化非甲基化的DNA的水解，其切割位

點可知、固定是，是最常用的限制性核酸內切酶；3、第三型（TypeIII）：同時具有修飾及認知切割的作用徐師大-屈艾老師制作28四．核酸內切限制酶的類型特性（7項）I型II型III型限制和修飾活性單一多功能的酶分開的核酸內切酶和甲基化酶具有一種共同亞基的雙功能的酶核酸內切限制酶的蛋白質結構3種不同的亞基單鏈多肽2種不同的亞基徐師大-屈艾老師制作29五、Ⅱ型核酸限制性內切酶的基本特性1.為單鏈多肽,最適pH6-8,能被鹽抑制、被Mg2+激活；2.底物DNA分子雙鏈中有特異性識別序列

通常有4-8個bP甚或更多，大都為一回文對稱的結構（即識

別序列）3.一般可在特異性識別序列內切割雙鏈DNA分子（有例外），產生鏈的斷裂，斷裂端有粘性末端和平齊末端之分。

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表：幾種常見的限制性核酸內切酶徐師大-屈艾老師制作31六、識別序列識別序列又叫核酸內切酶的切割位點或靶序列?；匚男蛄械母拍睿壕哂刑禺愋宰R別的反向重復序列稱為回文序列。識別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結構。徐師大-屈艾老師制作32

七、

切割類型檢驗大量的實驗事例之后發(fā)現，由核酸內切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割類型，通常是屬于下述兩種排列方式之一：（1）兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片段（3’-和5’-

）；（2）兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平齊末端的DNA片段。八、末端粘性末端：當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時，產生的就是黏性末端意義：

1、便于連接：只要粘性末端互補就可以連接；2、5’端標記：凸出的5’末端可以用DNA多核苷酸激酶進32P標記。凸出的3’端可以通過末端轉移酶

添加幾個多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等）

造成人工粘性末端；

3、補平成平齊末端：在DNA聚合酶的作用下補齊末端平末端：而當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產生的則是平末端徐師大-屈艾老師制作36

九、產生的末端特征

我們所說的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構（若是-3），它們能夠通過互補堿基間的配對而重新連結起來。

平末端的DNA片段與粘性末端相比，則不易于重新連結，耗能多。有些限制性酶(約10種，如BbVⅠ等)，其識別序列不表現為回文結構，它們降解雙鏈DNA時，酶切點大部分不在識別序列內，而是與識別序列相距5至13個核苷酸殘基不等徐師大-屈艾老師制作38十．影響核酸內切限制酶活性的因素（5點+1）

DNA的純度DNA的甲基化程度酶切消化反應的溫度DNA的分子結構

核酸內切限制酶的緩沖液

關于限制性內切酶的星活性徐師大-屈艾老師制作391、DNA的純度核酸內切限制酶消化DNA底物的反應效率，在很大程度上是取決于所使用的DNA本身的純度。若污染了在DNA制劑中的某些物質后例如蛋白質、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸鈉、以及高濃度的鹽離子等都有可能抑制核酸內切限制酶的活性。徐師大-屈艾老師制作40

為了提高核酸內切酶對低純度DNA的反應效率，一般采用如下三種方法：①增加核酸內切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達10單位甚至更多些。（加大成本）②擴大酶催化反應的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳叵♂尅＂垩娱L酶催化反應的保溫時間。

41在有些DNA制劑中（尤其是按微量堿法制備的）會含有少量的Dnase（活性需要有Mg2+的存在）的污染。而在DNA的貯存緩沖液中含有螯合二價金屬離子的EDTA，因此在這種貯存制劑中的DNA仍然是穩(wěn)定的。然而在加入了核酸內切限制酶緩沖液之后（內含Mg2+），DNA則會被DNase迅速地降解掉。要避免發(fā)生這種情況，唯一的辦法就是使用高純度的DNA。徐師大-屈艾老師制作42

2、DNA的甲基化程度

限制性核酸內切酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，會強烈地影響酶的活性。

為避免產生這樣的問題，在基因克隆中使用的是從失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備的質粒DNA。

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3、酶切消化反應的溫度

不同的核酸內切限制酶，具有不同的最適反應溫度，而且彼此之間有相當大的變動范圍。大多數核酸內切限制酶的標準反應溫度都是37℃，但也有許多例外的情況。其中有些核酸內切限制酶的最適反應溫度低于標準的37℃例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸內切限制酶的最適反應溫度則高于標準的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；還有些核酸內切限制酶的最適反應溫度可高達60℃以上。消化反應的溫度低于或高于最適溫度，都會影響核酸內切限制酶的活性，甚至最終導致完全失活。徐師大-屈艾老師制作44

4、DNA的分子結構

DNA分子的不同構型對核酸內切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內切限制酶切割超螺旋的質粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達20倍。此外，還有一些核酸內切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率亦有明顯的差別。據推測，這很可能是由于側翼序列的核苷酸成份的差異造成的。

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5、限制性核酸內切酶的反應緩沖液

核酸內切酶的標準緩沖液的組份包括：

氯化鎂或醋酸鎂，氯化納或醋酸鉀Tris-HCl（-AC）,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)牛血清白蛋白（BSA）酶活性的正常發(fā)揮，是絕對需要二價陽離子的，通常是Mg2+。購買時廠家會提供專門的緩沖液并有說明其成分。有些核酸內切酶可以在2種甚至4種緩沖液中均有較高的催化活性。

對絕大多數限制酶來說，在pH=7．4的條件下，其功能

最佳，一般為pH6—8。徐師大-屈艾老師制作46

6.星活性在“非最適的”反應條件下(包括高濃度的核酸內切限制酶、高濃度的甘油、低離子強度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)有些核酸內切限制酶識別序列的特異性便會發(fā)生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現象稱為Star活性。

有些核酸內切限制酶的切割特異性，受所用的緩沖液成份的影響比較明顯。例：EcoRI限制酶，在正常的情況下，是在G↓AATTC識別序列處發(fā)生切割作用的，但如果緩沖液中的甘油濃度超過5％（體積分數），那么其識別序列的特異性就會發(fā)生松動，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用。EcoRI限制酶的這種特殊的識別能力，通常叫做星活性，以EcoRI*表示。徐師大-屈艾老師制作47七、限制酶消化反應的步驟例：0．2—1．0ugDNA進行消化的典型反應步驟如要對更大量的DNA進行消化，則反應的各個成分須相應放大。將DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻，使總體積為18ul。加入2ul適當的10X限制酶消化緩沖液。輕敲管外壁以混勻之。加入1—2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻之。徐師大-屈艾老師制作48將上述混合的反應物置于適當溫度并按所需的時間進行溫育。加入0．5mol／LEDTA(pH8．0)使終濃度達10mmol／L，以終止反應。如果消化后DNA直接進行凝膠電泳分析，可加入6ul凝膠電泳加樣緩沖液，振蕩混合后，即可加樣進行電泳。純化消化后的DNA，可用酚：氯仿和氯仿各抽提1次，再用乙醇沉淀DNA。徐師大-屈艾老師制作49

六.限制性內切酶反應的終止

消化DNA樣品后，在進一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內切酶的活性，大多數限制性內切酶的鈍化方法是65℃溫浴5分鐘。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ對熱穩(wěn)定，則需加入終止反應液(如加入0．5mol／L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10mmol/L)？以終止反應。此外，還可以用等體積的酚抽提酶解產物，提取DNA。如果用限制性內切酶消化DNA分子后，為了進行凝膠電泳分析，則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液，振蕩混合后，直接上樣進行凝膠電泳。徐師大-屈艾老師制作50八.使用限制酶的注意點（4點）1、限制酶十分昂貴!遵循以下建議可以最大限度地節(jié)省開支。為能從貯存管內取出小量的酶，只要用一次性使用的移液器吸頭在酶溶液表面輕沾一下即可。這樣，你可以取到至少0．1ul的酶量。濃縮的限制酶也可在使用前用1X限制酶緩沖液稀釋。但切勿用水稀釋以免酶變性。徐師大-屈艾老師制作513、盡量減少反應中的加水量以使反應體積減到最小。但要確保酶體積不超過反應總體積的1／10，否則，限制酶活性將受到甘油的抑制。4、

通常延長消化時間可使所需的酶量減少。這在切割大量DNA時不失為一大節(jié)約方法。在消化過程中，可取少量反應液進行微膠電泳以判斷消化進程。瓊脂糖凝膠電泳（DNA）主要內容常見問題與解決辦法相關概念實驗方法凝膠電泳

當一種分子被放置在電場當中時,它們就以一定速度移向適當的電極，這種電泳分子在電場作用下的遷移速度,叫做電泳的遷移率，它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。在電泳中使用一種無反應活性的穩(wěn)定的支持介質,可使對流運動降低，故電泳的遷移率與分子摩擦系數成反比。因此根據分子大小的不同、構成或形狀的差異,以及所帶的凈電荷的多少,便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。

生理條件下,核酸分子的糖—磷酸骨架中的磷酸基因呈離子狀態(tài),因此,當核酸分子被放置在電場中時,它們就會向正電極的方向遷移。由于糖—磷酸骨架結構上的重復性質,相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因而它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下,DNA分子的這種遷移速度,亦即電泳的遷移率,取決于核酸分子本身的大小和構型,分子量較小的DNA分子比分子量較大的DNA分子遷移要快些。這就是應用凝膠電泳技術分離DNA片段的基本原理。瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質太大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用于核酸的研究中。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。決定因素

DNA的分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

瓊脂糖濃度一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。決定因素

DNA分子的構象

DNA分子處于不同構象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關，還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而開環(huán)雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發(fā)現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

電源電壓在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。

嵌入染料的存在熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15%。

離子強度影響電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA），一般配制成濃縮母液，儲于室溫。實驗步驟實驗器械實驗方法試劑配制

1.5×TBE緩沖液：450mmol/LTris-硼酸，10mmol/LEDTA，pH值8.0。使用時將上述儲存液稀釋10倍至0.5×TBE緩沖液，可同時作為電泳及制膠用的緩沖液。制膠1.根椐制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準確稱量的瓊脂糖粉（總液體量不宜超過錐瓶的50%）。瓊脂糖粉末與0.5×TBEbuffer的比例參考下表，常用瓊脂糖濃度為0.7-1%。瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍實驗方法—制膠1.在錐瓶的瓶口上蓋上保鮮膜或牛皮紙，并在膜或紙上扎些小孔，然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時，當溶液沸騰后，請戴上防熱手套，小心搖動錐瓶，使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復數次，直至瓊脂糖完全溶解。2.使溶液冷卻至50℃-60℃左右，如需要可在此時加入溴化乙錠溶液（終濃度0.5μg/ml）或按照1μL/30mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混勻。3.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5mm之間。制膠模如下圖所示，小膠倒入25-30mL左右瓊脂糖溶液，大膠則60-70mL左右，若需切膠回收，凝膠可適當加厚。4.在室溫下使膠凝固，大約30分鐘~1小時。實驗方法—上樣1.取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻（如：1μl樣品與5μl6×上樣緩沖液），用微量移液槍小心加入樣品槽中。2.上樣量根據樣品濃度可適當調整，若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量（一般小孔40μl為上限，大孔200μl為上限，具體和制膠膜規(guī)格相關）。3.每加完一個樣品要更換槍頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。實驗方法——電泳1.加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?10V，電流在40mA以上。2.當條帶移動到距凝膠前沿約2cm時（約40min），停止電泳。3.紫外下拍照并觀察。注意事項1.5×TBE緩沖液放置時間過久會沉淀，因此一次性不要配太多。工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液，取5×TBE緩沖液貯存液稀釋，現配現用。2.用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統(tǒng)一。3.瓊脂糖粉在微波爐中加熱時間不宜過長，每次當溶液起泡沸騰時停止加熱，否則會引起溶液過熱暴沸，造成瓊脂糖凝膠濃度不準，也會損壞微波爐。溶解瓊脂糖時，必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會造成電泳圖像模糊不清。4.凝膠不立即使用時，用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。結果圖常見問題與解決辦法凝膠制備1.微波爐溶解瓊脂糖時，膠液沸騰沖溢出三角錐瓶微波爐加熱時膠液可能發(fā)生劇烈沸騰，

1）總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量

2）2%以上膠液設置中火加熱

3）膠液劇烈沸騰時，停止加熱，移開三角錐瓶，請戴上防熱手套，小心搖動三角錐瓶，然后再次加熱，膠液沸騰直至膠清澈，保證瓊脂糖完全溶解。2.瓊脂糖電泳圖像背景模糊不清瓊脂糖沒有完全溶解會造成電泳圖像背景模糊不清。完全溶解的瓊脂糖膠液清澈，三角錐瓶內壁應沒有粘附瓊脂糖顆粒。3.加熱后水分蒸發(fā)，如需要應加入熱的蒸餾水，補足到原來的重量，搖勻。電泳1.DNA條帶模糊，拖尾DNA降解。避免核酸酶污染。DNA上樣量過多。減少凝膠中DNA上樣量。電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。電泳條件不合適。電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度＜30℃,巨大DNA鏈，溫度應＜15℃，核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。DNA樣含鹽過高。泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。有蛋白污染。電泳前抽提去除蛋白。DNA變性。電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。2.DNA條帶淡弱或無DNA帶DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量。DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。DNA走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。分子大小相近的DNA帶不易分辨。增加電泳時間，使用正確的凝膠濃度。DNA變性：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，用10mmNaClBuffer稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上分析。3.DNAMARKER條帶扭曲配制凝膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時配制的。使用同時配制的緩沖液。電泳時緩沖液高過液面1－2mm即可。電泳時電壓過高?？梢栽陔娪厩?5分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔后，再調電壓。盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。EndPART21.RNA提取的原理和方法2.RT-PCR的原理和方法3.RNA瓊脂糖凝膠電泳結果和分析及其應用RNA提取的原理和方法主要內容RNA分類目的難點1.原理2.方法提取流程兩條途經知識拓展RNA提取的原理rRNA（80-85%）

tRNA、核內小分子RNA(10-15%)mRNA（1-5%）真核細胞質總RNA人類細胞質RNA提取原理返回分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應的蛋白產物分離提純RNA的目的返回核糖殘基的2'和3'位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能正確折疊恢復活性，不易失活需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性分離主要難點——RNA的不穩(wěn)定性返回RNA提取的方法實驗室酵母RNA的提取1.RNA的提取2.RNA的離心分離3.RNA的純化2、方法及原理RNA的提取流程

1、樣本前處理

2、細胞裂解——勻漿器

3、RNA的純化及獲得樣本的選擇樣本的保存樣品的選擇

選擇新鮮血液，不得超過4小時選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長旺盛的時期收集細胞選擇新鮮組織，生長旺盛的組織許多植物組織中富含酚類化合物。酚類物質的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。在植物材料勻漿時，酚類物質會釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚㈦S氧化程度的增加而加深，這一現象被稱為褐化效應。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結合，從而影響RNA的分離純化?？蓪⑿迈r血液先進行紅細胞裂解，得到的白細胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存較長時間去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzol-70℃保存較長時間推薦使用專門的RNA樣品儲存液進行儲存液氮或加入RNase抑制劑中保存，避免反復凍融樣品的保存返回勻漿器：用于使樣品均勻化的裝置，可使組織、細胞或細胞組分等破裂分散成小顆粒，成為比較均勻的懸浮液。常由精細加工的研棒、管子和電動攪拌器構成。返回

1.有效地使核蛋白復合體變性；

2.對內源ＲＮＡ酶的有效抑制；（最關鍵）

3.有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；

4.對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。RNA的提取的要點89焦碳酸二乙酯（DEPC)：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。異硫氰酸胍（TRIzol法）

：目前被認為最有效的RNA酶抑制劑。裂解組織同時使RNA酶失活常用的RNA酶抑制劑氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物。和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制酶的活性。

其他：SDS、尿素、硅藻土RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin):大鼠肝或人胎盤中提取得來。酸性糖蛋白。非競爭性抑制劑?？梢院投喾NRNA酶結合，使其失活。返回RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑1)，提取總核酸，然后直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA留在水相。2)，提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；第二種提取方法將導致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。方法一:總RNA的試劑盒快速提取

——TRIzol法

TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍(常用的RNA酶抑制劑）等物質，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。且是一種簡便、經濟、適合大量樣本的RNA提取方法

1.TRIzol法1）細胞裂解：用TRIZOL試劑直接從細胞或組織中提取總RNA2）流程簡述：提取液加酚氯仿水樣層（含RNA）和有機層（含蛋白和DNA）收集水樣層

RNA沉淀

純化的RNARNA離心異丙醇②乙醇、離心、去上清基因組DNA水相有機相RNA氯仿純化pH5.7離心加入裂解液(TRNzol-A+)離心、棄上清①離心、棄上清晾干（不完全）適量DEPC水溶解TRIzol法提取流程操作步驟1.樣品處理組織：50-100mg組織中加入1mlTROzlo試劑。單層細胞：加入TROzlo試劑1ml/cm2平板。懸浮細胞：處理前洗滌細胞，以防止RNA降解。每5-10×105動物、植物或酵母細胞，或1×107細菌加入1mlTROzlo試劑。2.將上述樣品于15-30℃靜置5min，使核蛋白充分解離。3.加入0.2ml（1mlTROzlo試劑）氯仿，蓋緊蓋子，充分劇烈振蕩15s并于15-30℃靜置2-3min。4.于2-8℃12000g離心15min。離心后樣品分層，上層水相中含RNA，下層有機相中含蛋白和DNA。5.取上清，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，于15-30℃靜置10min后，在管底會出現膠狀沉淀，即為RNA。6.于2-8℃12000g離心10min后棄去上清。7.向沉淀中加入1ml75%乙醇，輕輕混勻。8.于2-8℃7500g離心5min后棄上清9.將RNA樣品涼干（不要徹底干燥），加入適量DEPC水溶解（可于55-60℃促溶10min）。方法二:氯化鋰法提取總RNA本方法用高濃度尿素來使蛋白變性和抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA

，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片斷丟失的缺陷。1：對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞（107個細胞/ml），則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉移至Eppendof管中2：勻槳液在0－4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘3：取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復步驟24：沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘5：取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。6：70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。返回

擴展：RT-PCR100RT-PCR原理原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、OligodT及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。逆轉錄PCR（reversetranscriptionPCR）或者稱反轉錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形?？俁NA的提取cDNA第一鏈的合成PCRRT-PCR方法1.在0.5ml微量離心管中，加入總RNA1-5μg，補充適DEPCH2O使總體

積達11μl。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，輕輕混勻、

離心。

2.70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。然后加入

下列試劑的混合物：10×PCRbuffer2μl，25mMMgCl22μl，

10mMdNTPmix1μl，0.1MDTT2μl

輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。

3.加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min。

4.于70℃加熱15min以終止反應。

5.將管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解殘留的

RNA。