溫敏性殼聚糖

溫敏性殼聚糖 甘油磷酸二鈉鹽水凝膠的初步研究【摘要】目的探討溫敏性殼聚糖 甘油磷酸二鈉鹽水凝膠應(yīng)用于軟骨再生的可行性。方法制備殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉鹽水凝膠。將體外培養(yǎng)的小鼠軟骨細(xì)胞與水凝膠共培養(yǎng)，采用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在三維材料上生長分布的狀態(tài)。選取共培養(yǎng)1、2周的細(xì)胞水凝膠復(fù)合物，采用 半定量的方法檢測Ⅱ型膠原和聚合素兩種細(xì)胞外基質(zhì)在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的差異。結(jié)果制備的水凝膠具備生理性的pH值，在常溫下為液態(tài)，體溫狀態(tài)下為膠凍狀。熒光倒置顯微鏡顯示共培養(yǎng)2周時軟骨細(xì)胞呈球狀生長。細(xì)胞/2具有溫度敏感性，是一種生物相容性的溫固化凝膠?！娟P(guān)鍵詞】殼聚糖； 甘油磷酸二鈉鹽；溫度敏感材料

甘油磷酸二鈉鹽水凝膠ABSTRACT：ObjectiveToinvestigatethefeasibilityofnovelthermallysensitivechitosan/β-glycerophosphate(Ch/GP)hydrogelforchondrocytesregeneration.MethodsCh/GPhydrogelswereprepared.Fluorescentinvertedmicroscopy(FIM)wasusedtoshowthecellularproliferationandⅡandaggrecandetectedwitbelowroomtemperatureforencapsulatinglivingcells;theyformmonolithicgelsatbodytemperature.FIMshowsthatat2weeks,thecellsaregenerallyround.Inaddition,wefoundthatthenormalizedratioofcollagentypeⅡandaggrecan significantlyincreasedat2weeks,ascomparedtothatat1week(P<0.05).ConclusionThisstudyreportsforthefirsttimetheuseofCh/GPaqueoussolutionsasgellingsystems,suggestingthediscoveryofaprototypeforanewfamilyofthermosettinggelshighlycompatiblewithbiologicalcompounds.KEYWORDS：節(jié)滑液,,亦無神經(jīng)支配,損傷后其自身修復(fù)能力較差,,它能夠吸收大量的水分,聯(lián)作用而不會溶解于水中,只能溶漲且保持一定的形狀[1]水凝膠因其在組織再生[2-4][5-8]最近我們發(fā)現(xiàn)用具有相反電荷的多羥基鹽例如 甘油磷酸二鈉鹽（ ，GP)中和后的殼聚糖（chitosan，Ch）具備溫度敏感性。這種溶液能夠在室溫或者低于室溫的狀態(tài)下較長時間的保持37pH6.8～7.2。本試驗(yàn)的目Ch/GP溫固化系統(tǒng)的物理特征，為軟骨再生的細(xì)胞治療的可行性提供理論依據(jù)。材料與方法材料殼聚糖（高分子量，脫乙酰>95％）， 甘油磷酸二鈉鹽公司），培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibico公司）。其他試劑均為分析級。chitosan/GP復(fù)合凝膠200mg10ml0.1M的乙酸溶液中，邊添加邊用磁力攪拌器攪拌，至少1h。溶解完20minGP粉劑溶解于去離子水（45％，w/w）15min后，將冷GPGP的終濃度分別為1.8％和7.3％（w/v）。軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)、包裹及觀察v2.2 軟骨細(xì)胞在Ch/CMC凝膠中的三維培養(yǎng)細(xì)胞在凝膠中生長、分布情況如圖1所示。細(xì)胞定植在凝膠中，視角聚集到凝膠的不同層面可見軟骨細(xì)胞呈三維較均勻分布。培養(yǎng)2周（圖1）的細(xì)胞－水凝膠復(fù)合物用AO染色，熒光倒置顯微鏡下觀察可見軟骨細(xì)胞仍保持球形，視角聚集到凝膠的不同層面可見軟骨細(xì)胞呈三維較均勻分布。3 討論比，可注射性的生物材料具有可以與細(xì)胞均勻混合，與修復(fù)組織之間嵌合連接好，塑型容易的特點(diǎn)，且能通過關(guān)節(jié)鏡操作，治療簡單、安全、有效，適應(yīng)現(xiàn)代微創(chuàng)手術(shù)理念。丙烯、聚氧化丙烯等。與上述凝膠支架相比，殼聚糖不僅具有良好的生物相容性、降解性，還具有抗菌、止血、止痛，預(yù)防膝關(guān)節(jié)或肌腱粘連，延緩創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)軟骨退變等作用。其理化性質(zhì)和臨床應(yīng)用與透明質(zhì)mRNA表達(dá)，產(chǎn)生Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原和蛋白多糖。殼聚糖的降解產(chǎn)物可作為關(guān)節(jié)液中的硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸的合成原料，是關(guān)節(jié)軟骨的重要營養(yǎng)物質(zhì)殼聚糖只能溶解于酸性溶液， 甘油磷酸二鈉鹽的加入將殼聚糖溶液改造成溫固化的溶液。其凝固溫度與殼聚糖分子量無關(guān)，與脫乙酰度成負(fù)相關(guān)。因此，可通過選擇不同脫乙酰度的殼聚糖來控制凝膠的凝固溫度和時間。凝膠復(fù)合物還可以作為細(xì)胞因子或藥物大分子的緩釋體系，通過調(diào)整其體內(nèi)降解速度，制成可控制釋放大分子速度的載體物質(zhì)。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞隨其傳代而表型整個發(fā)生改變，正常的Ⅱ、Ⅳ型膠原合成減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原合成pHCh/GP2我們的試驗(yàn)初步證實(shí)脫乙酰度90％以上的殼聚糖稀鹽酸溶液和 甘油磷酸二鈉鹽水溶液混合后，pH37℃，15軟骨的功能及力學(xué)特性還有待進(jìn)一步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】RatnerBD,HoffmanAS.HydrogelsforMedicalandRelatedApplications[M].ACS,Washington,1976:1MatsudaT,MagoshiT.Preparationofvinylatedpolysaccharidesandphotofabricationoftubularscaffoldsaspotentialuseintissueengineering[J].Biomacromolecules,2002,3:942hydrogelswithneuraltissue:effectsofstructureandpolargroups[J].Biomaterials,1991,12:197BellamkondaR,RanieriJP,BoucheN,eta1.Hcells[J].JBiomedMaterRes,1995,29:663ZielinskiBA,AebischerP.Chitosanasamatrixformammaliancellencapsulation[J].Biomaterials,1994,15:1049EmerichDF,WinnSR,ChristensonL,eta1.AnovelapproachtoneuraltransplantationinParkinson'scoextrusionwithanorganicpolymersolution[J].Biomaterials,1991,12:50n，e，n,t.sfnnte.,20：1937吳海ft，[J]軍醫(yī)學(xué)雜志，1995，20(6)：4054BALB/c小鼠，重量約20～30g膠原酶消2h10100U/ml100μg/mlDMEM37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)原代培養(yǎng)成功細(xì)胞生長增殖形成單層細(xì)胞后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在冰浴的環(huán)境下，4～5Ch/GP106個/ml63730min10％的胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)每312周的細(xì)胞/水凝膠復(fù)合物進(jìn)行熒光倒置顯微鏡觀察。采用免疫熒光染色方法處理標(biāo)本，即刻觀察并照相。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（