細胞化學(xué)染色

細胞化學(xué)染色

(cytochemicalstain)

檢驗科鄒偉麗概述

細胞化學(xué)(組織化學(xué)，組化)染色以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)并結(jié)合化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)，對細胞內(nèi)各種化學(xué)成分、代謝產(chǎn)物作定位、定性和半定量檢查的一門科學(xué)?？蓮浹a單純細胞形態(tài)學(xué)檢查識別的不足。細胞化學(xué)染色臨床意義:1.明確或輔助判斷急性白血病的細胞類型。因為不同細胞系列，其所含的化學(xué)物質(zhì)成分、分布及含量各有不同。因此根據(jù)細胞化學(xué)染色結(jié)果不同，可推斷所屬的細胞系列。2.某些疾病的診斷和鑒別診斷。因為血細胞在病理情況下，其化學(xué)物質(zhì)成分及含量會發(fā)生改變，所以僅從細胞形態(tài)學(xué)觀察白血病的診斷正確率約50～70%，如果結(jié)合細胞化學(xué)染色則可提到90%以上。一、過氧化物酶染色（POX）

【原理】粒細胞和單核細胞的胞漿中含有髓過氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）,能將底物H2O2分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧，它能夠?qū)⑺募谆?lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍。聯(lián)苯胺藍自我脫氫氧化，則顯棕色四甲基苯醌二胺。若加入亞硝基鐵氰化鈉與聯(lián)苯胺藍結(jié)合，可形成穩(wěn)定的藍黑色顆粒，定位于細胞漿酶所在部位。【標本要求】一般用新鮮的骨髓涂片做POX染色；如果外周血中白血病細胞多而骨髓涂片不夠的情況下，可選擇新鮮的血涂片來做。為了保證酶的活性，片子一般應(yīng)在固定后一周內(nèi)完成染色。【染色方法】一、試劑：甲液：聯(lián)苯胺（0.3g）；95%乙醇（99ml）；亞硝基氰化鈉飽和溶液（1ml）乙液：3%過氧化氫（0.3ml）；蒸餾水（2ml）注：乙液必須現(xiàn)配現(xiàn)用（5mlH2O+1滴H2O2）二、染色：1.滴加甲液在干的涂片上。2.待30秒后滴加乙液。（比例為2:1）3.過3-4分鐘后用自來水沖洗3-4分鐘。4.復(fù)染15分鐘?！菊Ｑ毎娜旧Y(jié)果】細胞中如有藍黑色即為陽性細胞。根據(jù)陽性顆粒的有無及多少，將染色結(jié)果分為（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。陽性反應(yīng)細胞陽性強度陽性特征陰性反應(yīng)細胞部分原粒細胞+~++顆粒細小，分布稀疏早幼粒細胞++~++++顆粒狀或彌散狀中性成熟粒細胞++~+++同上嗜酸性粒細胞++~++++粗顆粒狀，密集少數(shù)單系細胞+~++細小，彌散，較少

部分原粒細胞嗜堿性粒細胞大部分單系細胞淋巴細胞漿細胞紅系細胞POX染色臨床意義

由于POX在淋系細胞中不顯示，而在粒系和單系中顯示，使其區(qū)分急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓細胞白血病(AML)的分型中具有重要意義。（陽性率>3%即診斷為AML*M0除外）。陰性的結(jié)果見于多種急性白血?。ǖ赡茏畲蟮氖橇馨图毎籽。?。其次觀察成熟中性粒細胞的POX活性有助于其他疾病的診斷，如有些骨髓異常綜合征、放射病可使中性成熟粒細胞此酶活性下降。二、過碘酸－雪夫反應(yīng)(PAS)【原理】

過碘酸是強氧化劑，它作用于細胞內(nèi)含有乙二醇基的多糖類物質(zhì)（如糖原、粘多糖、糖蛋白及糖酯等），使之氧化，形成雙醛基。醛基與雪夫試劑中的無色品紅結(jié)合，使無色的品紅變成紅色或紫紅色化合物，定位于含有多糖類的細胞中?！緲吮疽蟆恳话阌霉撬杵鯬AS染色，如外周血中白血病細胞多的患者也可用血涂片來做。但如果觀察的是幼紅細胞，只能用骨髓涂片來做，因為一般情況下血涂片中幼紅細胞不多。由于PAS染色是對于多糖類物質(zhì)進行的一種半定量分析，所以也可用陳舊的未染色片子?！救旧椒ā?.新鮮血片或骨髓片用0.95%乙醇固定10分鐘。2.10g/L過碘酸氧化20分鐘。3.水洗3-5分鐘，沖洗掉多余的過碘酸，晾干。4.經(jīng)無色品紅液室溫中染色30-60分鐘。5.SO2液中漂洗3次。6.流水沖5分鐘，再用蒸餾水洗。7.用甲基綠復(fù)染2-10分鐘。8.流水沖洗，干后鏡檢?！菊Ｑ毎娜旧Y(jié)果】細胞中有紅色即為陽性細胞。再根據(jù)陽性顆粒的有無及多少，可分為（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。（-）：胞質(zhì)無顆粒（+）：胞質(zhì)內(nèi)有顆粒（++）：有較粗紅色顆粒（+++）：有粗大紅色顆粒（++++）：顆粒粗大并有紅色塊狀PAS染色臨床意義1.紅血病、紅白血病及貧血類型的鑒別：紅血病、紅白血病、重型地貧及缺鐵貧以及MDS時幼紅細胞呈強陽性，但極少數(shù)紅白血病可呈陰性；溶貧時幼紅細胞呈陰性或弱陽性；再障、巨幼貧時幼紅細胞呈陰性。2.白血病類型的鑒別：急粒時原粒呈陰性或弱陽性，以彌漫性為主；急淋時原、幼淋多呈塊狀陽性反應(yīng)，少數(shù)呈陰性反應(yīng)；急單時原、幼單核細胞呈陽性反應(yīng)，其顆粒細小，彌散分布。三、酯酶染色不同血細胞中所含酯酶的成分不同。根據(jù)酯酶特異性高低分為特異性酯酶（SE）和非特異性酯酶（NSE）。特異性酯酶就是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色；非特異性酯酶的種類有多種，根據(jù)pH值不同分為酸性、中性和堿性酯酶，包括了酸性非特異性酯酶（即酸性α-醋酸萘酚酯酶）、堿性非特異性酯酶（即α-丁酸萘酚酯酶）和中性非特異性酯酶，后者包括α-醋酸萘酚酯酶、醋酸AS-D萘酚酯酶等。目前顯示血細胞中酯酶的方法均采用偶氮偶聯(lián)法。

酸性α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）

【原理】

血細胞內(nèi)的α-NAE在pH中性條件下，水解基質(zhì)液中的α-醋酸萘酚并釋放出α-萘酚，進而與基質(zhì)液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性有色沉淀，定位于細胞質(zhì)內(nèi)酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢藍B，形成的有色沉淀為棕黑色或灰黑色。單核細胞系統(tǒng)的陽性可被氟化鈉抑制，所以做α-NAE染色時，通常同時做氟化鈉抑制試驗。

【標本要求】一般用新鮮的骨髓涂片來做該染色。如外周血中白血病細胞多而骨髓涂片不夠的情況下，可選擇新鮮的血涂片來做。做此染色時，通常要同時做氟化鈉抑制試驗，所以至少需要兩張片子。為了保證酶的活性，片子一般在固定后一周內(nèi)完成染色?！救旧椒ā?.取新鮮骨髓涂片置濃福爾馬林中蒸3分鐘。（2滴）2.放入作用液37℃溫箱30分鐘。作用液配制：取固蘭40mg，1%α-萘酚（以50%丙酮做溶劑）0.8ml，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.4）40ml混合，過濾后使用。3.用自來水沖洗，晾干。4.用1%沙黃復(fù)染45秒。5.水洗，晾干后鏡檢。注：該染色同時要做氟化鈉抑制試驗，主要步驟如下：將上述作用液分成兩份，其中一份再加入60mgNaF，然后分別將已固定的片子放入其中作用30分鐘，最后復(fù)染，鏡檢，比較兩張染色結(jié)果，判斷NaF抑制情況。【正常血細胞的染色結(jié)果】1.單核系

分化差的原單呈陰性，分化好的原單呈陽性（常較強），幼單及單核也呈陽性，陽性反應(yīng)能被氟化鈉抑制。所謂抑制是指氟化鈉試驗的抑制率大于50%。2.粒系

陰性或陽性，但陽性反應(yīng)不能被氟化鈉抑制。3.淋系

多數(shù)陰性，少數(shù)弱陽性，不能被氟化鈉抑制。4.其他細胞

巨核細胞和血小板呈陽性，陽性反應(yīng)不能被氟化鈉抑制；少數(shù)有核紅細胞呈弱陽性，陽性反應(yīng)不能被氟化鈉抑制；漿細胞呈陰性。

抑制率的計算公式：抑制率%=（抑制前陽性率-抑制后陽性率）×100抑制前陽性率

α-NAE臨床意義1.急性單核細胞白血病單核細胞多數(shù)陽性較強，且能被NaF抑制。2.急性早幼粒細胞白血病早幼粒呈強陽性，陽性但不能被NaF抑制。3.急性粒細胞白血病和急性淋巴細胞白血病原粒細胞、淋巴母細胞、幼淋巴細胞呈陰性或陽性，陽性不能被NaF抑制。4.急性粒單核細胞白血病原粒細胞呈陰性至陽性，但不被NaF抑制；原幼單呈陽性，能被NaF抑制，所以總的說，該白血病NaF抑制試驗是部分抑制。四、鐵染色【原理】正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細胞中。骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位。

鐵染色（ferricstain）化學(xué)反應(yīng)過程如下：

酸性4Fe3++3K4[Fe（CN）6]4[Fe（CN）6]3

+12K+（含鐵物質(zhì)）（亞鐵氰化鉀）（亞鐵氰化鐵）【標本要求】要求用新鮮的、含有骨髓小粒的骨髓涂片進行染色。陳舊的骨髓涂片鐵污染明顯而容易造成假陽性；如果骨髓涂片中無骨髓小粒，細胞外鐵就無法觀察；如果片中幼紅細胞很少或無，細胞內(nèi)鐵就無法觀察?！救旧椒ā恳?、試劑：2%低鐵氰化鉀液（10g亞鐵氰化鉀+500ml蒸餾水）和1%鹽酸（5mlHCL+495H2O),用時等量混合。二、染色：1.用新鮮配制的酸性亞鐵氰化鉀液染Z在37℃溫箱中作用30分鐘。2.用自來水沖洗，晾干。3.0.1%沙黃復(fù)染1分鐘。4.用自來水沖洗，晾干，鏡檢。【染色結(jié)果】幼紅細胞核呈鮮紅色，漿呈淡黃紅色，鐵粒呈藍綠色。細胞外鐵用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注意翠藍色顆粒的存在，可分五級標準。（-）：無顆粒。（+）：有少數(shù)鐵顆?；蚺家婅F小珠(顆粒體積大于嗜酸性粒細胞的顆粒者稱為鐵珠)。（++）：有較多的鐵顆粒和小珠。（+++）：有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)小塊狀。（++++）：有極多鐵顆粒、小珠，有很多的小塊，密集成堆。

細胞內(nèi)鐵用油鏡計數(shù)100個中、晚幼紅細胞，記錄胞漿中含有藍色鐵粒的紅細胞(鐵粒幼紅細胞)的百分率。根據(jù)細胞內(nèi)鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布的情況，將鐵粒幼紅細胞分為四型。Ⅰ型（+）：幼紅細胞內(nèi)含鐵粒1～2個。Ⅱ型（++）：幼紅細胞內(nèi)含鐵粒3～5個。Ⅲ型（+++)：幼紅細胞內(nèi)含鐵粒6～10個。Ⅳ型(++++)：幼紅細胞內(nèi)含鐵粒11個以上。環(huán)形鐵粒幼紅細胞

環(huán)形鐵粒幼紅細胞的標準為含鐵粒在6個以上，圍繞核周1／2以上者。有時成熟紅細胞中也出現(xiàn)鐵顆粒稱為鐵粒紅細胞。鐵染色的臨床意義

1、鑒別缺鐵性貧血、鐵粒幼細胞性貧血及某些溶血性貧血

缺鐵性貧血時骨髓細胞外鐵和內(nèi)鐵顯著減少或消失，經(jīng)鐵劑治療后細胞外鐵及內(nèi)鐵可迅速增多，此檢查是診斷缺鐵性貧血及指導(dǎo)鐵劑治療的一種輔助方法；非缺鐵性貧血，如溶血性貧血、巨幼紅細胞性貧血等病人的細胞外鐵可以增高，因此有助于鑒別缺鐵性貧