綜合實驗設(shè)計 水稻轉(zhuǎn)化

生物學(xué)綜合實驗技術(shù)水稻愈傷組織誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)GUS基因的鑒定一、實驗?zāi)康募耙螅和ㄟ^農(nóng)桿菌法將帶有報告基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草中，誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因植株。了解農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的原理，掌握農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和侵染植物的方法。二、實驗原理

農(nóng)桿菌重組子中攜帶經(jīng)改造的Ti質(zhì)粒（含有幫助T-DNA跳到植物染色體上的Vir區(qū)）和包含T-DNA的雙元載體pBinGUS，質(zhì)粒pBinGUS上T-DNA上插入了報告基因（GUS）和卡那霉素篩選標記基因NPTII。轉(zhuǎn)化是通過誘導(dǎo)形成愈傷組織，侵染時農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课?，受傷后雙子葉植物分泌的酚類化合物透過農(nóng)桿菌的細胞膜，活化vir區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使T-DNA進行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進入植物細胞后整合到核DNA上。共培養(yǎng)可使T-DNA上攜帶的編碼抗生素的抗性基因得到表達，因此，轉(zhuǎn)化了的水稻外植體可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。具備條件：（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來源（4）對選擇性抗生素敏感（5）對農(nóng)桿菌侵染有敏感性圖4：農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化A.水稻愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)B.選擇C.分化D.生根E.煉苗和移栽農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化gus基因簡介gus基因是目前常用的一種報告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表達產(chǎn)物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸

，它可以將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解為藍色的物質(zhì),也可以將4-甲基-傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解為藍色物質(zhì)。其檢測方法簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定，且背景活性低。gus基因的最大優(yōu)點是它能測定外源基因表達的具體細胞和組織部位，這是其它報告基因所不能及的。三、實驗方案與步驟Ⅰ水稻愈傷組織誘導(dǎo)Ⅱ農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化Ⅲ水稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化Ⅳ水稻抗性愈傷組織的篩選與分化ⅤGUS基因的染色Ⅰ水稻愈傷組織誘導(dǎo)1.水稻種子消毒：在超凈工作臺上，取大概40粒去殼、胚完整的水稻種子放入50mL無菌三角瓶中，用無菌水洗一遍之后倒掉無菌水，再倒入75%酒精之后，搖瓶30-60s，用無菌水再洗一遍后倒掉無菌水，倒入2%NaClO，不時攪拌，30min。然后用無菌水洗3次，每次搖瓶1min，倒掉無菌水，將種子放入帶無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，分開排布，吸干。2.水稻種子接種與觀察將吸干的種子接入YN培養(yǎng)基，注意使胚朝上。每瓶接10粒，每小組5瓶。寫上日期、接種人、放入培養(yǎng)室25℃暗培養(yǎng)。1周后調(diào)查計算污染率，2周后調(diào)查計算愈傷組織誘導(dǎo)率。污染率=污染種子數(shù)/總種子數(shù)×100%愈傷組織誘導(dǎo)率=出愈傷種子數(shù)/總種子數(shù)×100%3.水稻愈傷組織的繼代培養(yǎng)在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織（淡黃色，致密呈球狀），置入YYN培養(yǎng)基中，在28℃光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周。（如不馬上用于轉(zhuǎn)化，需轉(zhuǎn)移至暗處，于25℃繼續(xù)培養(yǎng)1周）Ⅱ農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3mL的YEB液體培養(yǎng)基（含Rif50mg·L-1）中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；取過夜培養(yǎng)菌液1mL接種于50mLYEB（Rif50mg·L-1）液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5；取2mL菌液，13000rpm，離心30s,棄上清；加入1000μL20mMCaCl2，使農(nóng)桿菌細胞充分懸浮，冰浴30min；13000rpm，離心30s，棄上清，置于冰上，加入500μL預(yù)冷的20mMCaCl2，充分懸浮細胞，冰浴中保存，24h內(nèi)使用，或液氮中速凍1min，置-70℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?00μL感受態(tài)細胞中加入2-6μLpCAMBIA1301質(zhì)粒DNA，冰浴5min，液氮中速凍5min；迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，熱激5min；加入1mLYEB液體培養(yǎng)基，28℃慢速振蕩培養(yǎng)2－4h；3000rpm離心4min，去一部分上清，留取200μL菌液涂布于含有50μg·mL-1Kan和50μg·mL-1Rif的YEB平板；放置約0.5h，待水份干后，28℃培養(yǎng)約24h至長出菌落。Ⅲ水稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化在侵染前三天挑取含有GUS基因的農(nóng)桿菌接種到3mLLB液體培養(yǎng)基中（25mg·L-1鏈霉素和50mg·L-1卡那霉素），28℃、200rpm培養(yǎng)至對數(shù)晚期(18-24h)。利用分光光度計測量菌液OD600值大約在0.6左右將1中獲得的菌液按1：100接種到50mL新鮮的NGN液體培養(yǎng)基中（25mg·L-1鏈霉素和50mg·L-1卡那霉素），28℃、200rpm培養(yǎng)至OD值為0.5左右（大約5-6h）。把50mL菌液轉(zhuǎn)入2個50mL離心管中，4℃、4000g10min，棄上清，加等體積的NGNM+AS培養(yǎng)基重懸菌體。準備NGN溶液：向50mL離心管中加入40mLNGN,注意：取800μL溶液滴加在GN培養(yǎng)基濾紙上（培養(yǎng)基上鋪一層干凈濾紙）。將水稻愈傷組織浸入準備好的農(nóng)桿菌中，侵染20min，期間要緩慢搖動。將浸染后的菌液倒出廢液缸，用滅菌過的針管或槍頭把殘余的菌液吸凈，再用濾紙把愈傷組織吸干，置于準備好的GN培養(yǎng)基上。22℃黑暗培養(yǎng)2d。Ⅳ水稻抗性愈傷組織的篩選與分化將共培養(yǎng)的水稻愈傷組織用無菌水洗滌6次，用無菌水+羧卞（500mg·L-1）洗滌2次（洗滌時要不停的搖晃50mL離心管，每洗滌一次用針管把無菌水吸出），用無菌紙吸干后置于工作臺吹30min。將水稻愈傷組織置于N6D2S固體篩選培養(yǎng)基上，26℃黑暗培養(yǎng)，每2周繼代一次，篩選4周。經(jīng)2次篩選生長旺盛的抗性水稻愈傷組織轉(zhuǎn)至XFM再生培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)4周以上，每兩周繼代一次。將經(jīng)過分化培養(yǎng)的水稻分化苗轉(zhuǎn)至GM培養(yǎng)基上，于三角瓶中生根壯苗。待水稻幼苗長至10cm左右，打開封口膜，煉苗2-3d，將水稻再生苗轉(zhuǎn)至盆缽中。ⅤGUS基因的染色挑取5塊抗性愈傷組織或5個抗性苗葉片與非轉(zhuǎn)化的對照放入7mL離心管，加入2mLGUS染色液，然后37℃水浴8h以上觀察水稻愈傷組織或者葉片的顏色，是否有藍色的斑點出現(xiàn)。染色后的愈傷組織或葉片在離心管中70%酒精脫色24h。體式顯微鏡下觀察水稻轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因組織的顏色，拍照并比較其異同。實驗操作及實驗報告要求（一）實驗操作要求1．實驗課前預(yù)習實驗內(nèi)容，熟悉實驗?zāi)康?、實驗原理、操作步驟以及實驗注意事項。2．實驗過程中嚴謹操作、仔細觀察、認真實驗并進行實驗記錄。3．準確認真完整清楚記錄實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)。4．必須掌握操作步驟和實驗流程后才能進行實驗。（二）實驗報告要求1．實驗報告嚴格按照如下格式和內(nèi)容書寫。實驗名稱實驗人、學(xué)號、實驗日期實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒灢牧戏椒ê筒襟E實驗結(jié)果（需照相機拍照）結(jié)果討論和結(jié)論

實驗思考題2．在寫實驗報告時，實驗?zāi)康暮驮響?yīng)按照該次實驗內(nèi)容和實驗步驟寫出，要明確具體、有針對性。實驗材料包括實驗所用的實驗植物或組織、重要的實驗試劑和儀器設(shè)備。實驗結(jié)果中應(yīng)包括全部實驗過程中觀察到的現(xiàn)象、實驗結(jié)果和實驗數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)中的圖表要有圖名和表名，圖名位于圖下方，表名位于表格上方。圖表需大小合適、標注清楚。圖表內(nèi)容和所包含