第05章-血細胞分析儀

Clinicallaboratorymedicine臨床檢驗儀器學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教研室郝艷梅1血細胞分析儀教學(xué)要求掌握血細胞分析儀的概念、庫爾特原理。熟悉聯(lián)合檢測型血細胞分析儀器的檢測原理，網(wǎng)織紅細胞檢測原理，血紅蛋白檢測原理、儀器性能評價和維護。了解血細胞分析儀的分類、基本結(jié)構(gòu)、常見故障和排除及進展。第五章臨床血液常規(guī)檢驗儀器P632第一節(jié)血細胞分析儀學(xué)習(xí)內(nèi)容一、血細胞分析儀的分型二、血細胞分析儀的檢測原理三、血細胞分析儀的基本結(jié)構(gòu)四、血細胞分析儀的性能指標(biāo)與評價五、血細胞分析儀的維護及常見故障六、血細胞分析儀的進展七、思考題3自動化血細胞分析儀由于操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確及精密度高，少量血液就可完成多項參數(shù)的分析，為臨床醫(yī)學(xué)提供了更多的診斷信息，現(xiàn)正逐漸取代傳統(tǒng)的顯微鏡計數(shù)法而被廣泛應(yīng)用。血常規(guī)化驗單

4顯微鏡計數(shù)法:速度慢、精密度不高，但是“金標(biāo)準(zhǔn)”不同種類細胞的細胞大小、胞漿中顆粒大小和性質(zhì)、核形態(tài)、核漿比例等不同。？5一、血細胞分析儀的分型血細胞分析儀(Bloodcellanalyzer,BCA)是指對一定體積全血內(nèi)血細胞數(shù)量和異質(zhì)性進行自動分析的臨床檢驗常規(guī)儀器；主要功能是血細胞計數(shù)、WBC分類、Hb測定、相關(guān)參數(shù)計算等。又稱血液細胞分析儀、血液分析儀、血球儀、血球計數(shù)儀63血細胞分析儀分型⒈按自動化程度：

半自動、全自動⒉按檢測原理：

電阻抗型、激光型、聯(lián)合檢測型等。⒊按對白細胞的分類水平：二分群、三分群、五分類、五分類+Ret等；血細胞分析流水線。7血細胞分析流水線①一臺或多臺全自動血細胞分析儀②機器人(完成條碼識別、開蓋混勻等)③單臺或多臺推片染色儀④軌道⑤計算機8檢測原理電學(xué)光學(xué)電阻抗法射頻電導(dǎo)法激光散射法分光光度法染色非染色二、血細胞分析儀的檢測原理RBC、PLT計數(shù)、低檔次儀器WBC計數(shù)：→應(yīng)用庫爾特檢測原理(微粒子電阻抗血細胞計數(shù)原理)五分類和高檔次儀器：→大多應(yīng)用以流式技術(shù)為主的聯(lián)合檢測原理Hb檢測：→多使用光電比色原理9血細胞與等滲的電解質(zhì)溶液相比為相對的不良導(dǎo)體血細胞電阻值大于稀釋液的電阻值。1.電阻抗型血細胞分析儀檢測原理（一）血細胞分析儀的細胞計數(shù)原理-+10※Coulter原理：在由外電極、內(nèi)電極和電解質(zhì)稀釋液組成的電路上→懸浮在電解質(zhì)稀釋液中的血細胞經(jīng)負壓吸引通過檢測器的微孔時→產(chǎn)生短暫的電阻增大變化→形成電壓脈沖信號→并經(jīng)計算機處理→脈沖數(shù)被轉(zhuǎn)化為細胞數(shù)，脈沖信號幅度則與細胞體積大小呈正相關(guān)。U=ⅠR116血液中各種血細胞的體積不同，WBC體積范圍120～1000fl，RBC在85～95fl，PLT在2～30fl,血細胞計數(shù)便是利用它們的體積及數(shù)量不同。為未加入溶血素前體積體積不同，脈沖大小不同，WBC最大，RBC次之，PLT最小。各種不同大小細胞產(chǎn)生的脈沖信號分別通過：放大、閾值調(diào)節(jié)和甄別、整形、計數(shù)得出各種細胞計數(shù)結(jié)果。12※脈沖信號和細胞體積直方圖的關(guān)系7橫坐標(biāo)為血細胞體積大小縱坐標(biāo)為不同體積細胞的相對頻率。13實際進行血細胞分析時：WBC為一個檢測器。RBC和PLT為一檢測器。1435－9090－160160－450-+（1）白細胞的檢測細胞懸液加溶血素后送入白細胞檢測器。小細胞群中間細胞群大細胞群15第一群：小細胞區(qū)，主要是LC，體積在35-90fl;第二群：單個核細胞區(qū)，也稱為中間細胞群，體積在90-160fl，包括MC、Eos、Bas、核左移白細胞、原始或幼稚階段白細胞；第三群：大細胞區(qū)，主要是NC，體積在160fl以上。淋巴嗜堿單核嗜酸中性粒細胞16提示：原始、幼稚白細胞增多提示：LC減少和NC增多提示：LC增多和NC減低提示：中間細胞群增多用顯微鏡人工復(fù)檢17（2）紅細胞和血小板的檢測

紅細胞和血小板共用一個檢測器（小孔管）。-+18CPU對血小板和紅細胞分布圖進行判斷正常人紅細胞體積和血小板體積間有一個明顯界限，血小板計數(shù)準(zhǔn)確容易。19fL當(dāng)血細胞懸液中含有異常血細胞（如小RBC）時，劃分界限不清。為使PLT計數(shù)有較高的準(zhǔn)確性，計算機對PLT和RBC分布圖進行判斷，將PLT計數(shù)的上限閾值判定線放在RBC和PLT分布圖交叉部分的最低處計數(shù)。20紅細胞和血小板檢測的直方圖21紅細胞直方圖小RBC且大小不均

β-地中海貧血MCV↓RDW↑MCV↓RDW-紅細胞分布寬度（RDW）22大RBC且大小不均MCV↑RDW↑23血小板直方圖細胞碎片的影響24用顯微鏡人工復(fù)檢25262.聯(lián)合檢測型血細胞分析儀檢測原理前鞘流后鞘流檢測窗聯(lián)合分類技術(shù)是以流式技術(shù)為基礎(chǔ)再聯(lián)合使用電阻抗、射頻和電導(dǎo)、激光散射、細胞化學(xué)染色等多項技術(shù)進行細胞分析，并綜合分析檢測數(shù)據(jù)，從而得出較為準(zhǔn)確的五分類結(jié)果。共有特點是：均使用了鞘流技術(shù)。將經(jīng)試劑稀釋、染色、球形化的細胞懸液注入鞘液流中央，單個細胞隨懸液和鞘液流兩股液流整齊排列，以恒定流速定向通過石英毛細管。NC、LC、MC、Eos、Bas、異常細胞27Volumeconductivitylightscatter,VCS①電阻抗技術(shù)：檢測細胞體積和數(shù)量。(1)容量、電導(dǎo)、光散射聯(lián)合檢測原理每個細胞接受三維分析，定義到三維散點圖的相應(yīng)位置。

28射頻電導(dǎo)：射頻電流，每秒變化大于1萬次的高頻交流電磁波，能通過細胞膜。細胞膜對高頻電流具有傳導(dǎo)性，當(dāng)電流通過細胞時，細胞核和細胞質(zhì)的理化組份可使電流的傳導(dǎo)性產(chǎn)生變化。②電導(dǎo)性(conductivity，C)：采用高頻電磁探針，測量細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)核漿比例、胞質(zhì)顆粒的大小和密度，從而區(qū)別體積完全相同而性質(zhì)不同的兩個細胞。29激光散射：激光束能穿透細胞，細胞因本身的各種特性(細胞內(nèi)核分葉狀況和胞漿中的顆粒情況)可阻擋或改變激光束的方向，產(chǎn)生與細胞特征相應(yīng)的各種角度的散射光。低角度散射光：前向散射光，反映細胞的數(shù)量和體積大小。③高角度散射光：側(cè)向散射光，反映細胞內(nèi)核分葉狀況和胞漿中的顆粒等情況，可以區(qū)分出顆粒特性不同的細胞群體。

光散射(scatter，S)30儀器根據(jù)細胞體積、傳導(dǎo)性和光散射的不同，綜合分析三種檢測方法的測定數(shù)據(jù)，定義到三維散點圖的相應(yīng)位置，全部單個細胞在散點圖上形成了不同的細胞群落圖→得出WBC分類值。使用VCS技術(shù)后，每個細胞通過檢測區(qū)時，接收三維分析，不同的細胞在細胞體積、表面特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等方面完全一致的幾率很小。各類白細胞在VCS三維空間中的分布特點31立體散點圖平面散點圖32原理是一定體積的全血標(biāo)本用鞘流液按適當(dāng)比例稀釋。WBC內(nèi)部結(jié)構(gòu)近似于自然狀態(tài)，在水動力系統(tǒng)的作用下，樣本被集中為一個直徑為30μm的小股液流，該液流將稀釋細胞單個排列，因是單個通過激光束，故在各個方向都有其散射光?？梢詮乃膫€角度測定散射光的密度：

（2）多角度激光散射、電阻抗聯(lián)合檢測原理

33測定細胞大小和數(shù)量測細胞結(jié)構(gòu)和核質(zhì)復(fù)雜性測細胞內(nèi)部顆粒和分葉狀況成分10°散射90°去偏振散射光顆?？梢詫⒋怪苯嵌鹊钠窦す庀竦奶匦?，區(qū)別NC和EOS34基于WBC大小、折射率、核形、核漿比值、以及顆粒性質(zhì)等，均可影響不同角度下的散射光強度。不同WBC在以上幾個方面完全一致的幾率很小，從而對白細胞進行分類。0°和90°垂直光散射強度：分為單核（LC、MC、Bas）和多個核（NC、Eos）90°垂直光散射和90°消偏振光散射強度:

區(qū)分NC和Eos0°和10°光散射強度:

LC、MC、Bas3536這類儀器是應(yīng)用激光散射與細胞化學(xué)染色技術(shù)對白細胞進行分類計數(shù)。（3）光散射與細胞化學(xué)聯(lián)合檢測原理37①激光與過氧化物酶檢測通道：不同白細胞的過氧化物酶活性不同，從強到弱依次為：EOS、NC、MC，而LC和Bas則無。因此，細胞經(jīng)過氧化物酶染色后，胞質(zhì)內(nèi)即出現(xiàn)細胞化學(xué)反應(yīng)，以X軸為吸光率（酶反應(yīng)強度），Y軸為光散射（細胞大?。╋@示檢測結(jié)果，每個細胞產(chǎn)生的這2個信號可定位在細胞散點圖上。由于LC和Bas均無過氧化物酶活性，儀器獲得白細胞4個亞群(EOS、NC、MC、LC+Bas)。細胞大小酶反應(yīng)強度單細胞38酶反應(yīng)強度細胞體積大小39

②Bas細胞檢測通道：該通道可進一步區(qū)分LC和Bas

。Bas利用“時間差”與紅細胞/血小板使用共同的檢測通道。當(dāng)血液進入Bas通道時（此時RBC、PLT已檢測完畢），血液與酸性表面活性劑反應(yīng)，RBC被溶解，除Bas外，其他所有WBC膜均被破壞，胞質(zhì)溢出，僅剩裸核。40圖3-13嗜堿粒細胞通道試劑反應(yīng)示意圖41激光照射Bas后，產(chǎn)生散射光的變化，形成二維細胞圖。完整的Bas呈高狹角散射，定位于圖的上半部，裸核位于圖下半部。42（4）電阻抗、射頻與細胞化學(xué)聯(lián)合檢測原理這類儀器是利用電阻抗、射頻這一成熟細胞計數(shù)技術(shù)結(jié)合細胞化學(xué)技術(shù)，通過4個不同的檢測系統(tǒng)對白細胞、幼稚細胞進行分類和計數(shù)。①LC、MC和粒細胞檢測系統(tǒng)：②EOS細胞檢測系統(tǒng):

血液與特殊溶血劑混合，留完整的EOS，電阻抗原理計數(shù)。③Bas細胞檢測系統(tǒng)：④幼稚細胞檢測系統(tǒng)：IMI（immaturemyeloidinformation）未成熟細胞信息43RF:射頻電流DC:直流電細胞大小的信息細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息電阻抗與射頻法白細胞分類檢測散點圖①淋巴、單核和粒細胞檢測系統(tǒng)44幼稚細胞檢測系統(tǒng)檢測原理45（5）網(wǎng)織紅細胞檢測原理RET中嗜堿性物質(zhì)RNA，在活體狀態(tài)下與特殊的熒光染料結(jié)合。熒光強度與RNA含量成正比。用流式細胞術(shù)檢測

RET大小和RNA含量及Hb的含量。反應(yīng)前反應(yīng)后RET等與試劑反應(yīng)前后的變化熒光(RNA)強度前向散射光46熒光(RNA)強度ReticulocytesPLTRBC高熒光強度低熒光強度中熒光強度WBC前向散射光(細胞大小)血細胞分析儀網(wǎng)織紅細胞成熟度分類47將血液充入到含特殊試劑（抗凝劑、熒光染料）的毛細管內(nèi)專用離心機上離心，儀器根據(jù)血中各種血細胞成份的比重不同分層亦不同的原理，血細胞被吖啶橙染色后，各層細胞會有明顯的顏色差異，然后將毛細管放在特殊的判讀機上對不同細胞層進行比對定量分析。計算機綜合信息處理，得到紅細胞、中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、血小板、血紅蛋白等參數(shù)。3.干式離心分層型血細胞分析儀的細胞計數(shù)原理(了解)48(二)血紅蛋白測定原理采用光電比色原理當(dāng)液體性質(zhì)和厚度固定后，則吸光度與液體物質(zhì)濃度成正比血細胞懸液中加入溶血劑后，RBC溶解釋放出Hb，后者與溶血劑中有關(guān)成分結(jié)合形成Hb衍生物，進入Hb測試系統(tǒng)特定波長(530～550nm)下進行光電比色，吸光度值與所含Hb含量成正比，經(jīng)儀器計算顯示Hb濃度。儀器Hb校正必須以HiCN值為準(zhǔn)。49血細胞分析儀基本流程P7050基本結(jié)構(gòu)機械系統(tǒng)電學(xué)系統(tǒng)血細胞檢測系統(tǒng)血紅蛋白測定系統(tǒng)計算機控制系統(tǒng)三、血細胞分析儀的基本結(jié)構(gòu)(實驗課)51(一)機械系統(tǒng)(實驗課)包括機械裝置（如全自動血細胞分析儀有：進樣針、分血器、稀釋器、混勻器、定量裝置等）和真空泵，以完成樣本的定量吸取、稀釋、傳送、混勻，以及將樣本移入各種參數(shù)的檢測區(qū)。兼有清洗管道和排除廢液的功能。52(二)電學(xué)系統(tǒng)

包括主電源、電壓元器件、控溫裝置、自動真空泵電子控制系統(tǒng)，以及儀器的自動監(jiān)控、故障報警和排除等(實驗課)53國內(nèi)常用的血細胞分析儀，使用的檢測技術(shù)可分為電阻抗檢測技術(shù)和流式光散射檢測技術(shù)兩大類(三)血細胞檢測系統(tǒng)-+1.電阻抗檢測系統(tǒng)檢測器：儀器配兩個小孔管，一個小孔管的微孔直徑約為80um，用來測定RBC和PLT；另一個小孔管的微孔直徑約為100um，用來測定WBC總數(shù)及分類計數(shù)。54(檢測器)電阻抗檢測系統(tǒng)5556重疊損失補償理想情況是細胞一個個的通過小孔，但是孔的直徑100um，所以在實際操作過程中，會存在兩個、三個甚至更多細胞，一同或前后尾隨進入小孔的可能性，這種情況雖然產(chǎn)生脈沖，脈沖幅度比單個細胞要高，但它只能產(chǎn)生一個信號脈沖，使計數(shù)有所丟失，這種現(xiàn)象稱為重疊損失。(三)血細胞檢測系統(tǒng)57細胞A細胞B檢測脈沖檢測脈沖58重疊校正規(guī)律：計算值在8000以下時不校正，計數(shù)值在8000～38000時，每計數(shù)1000個，補充100個，即在這個范圍內(nèi)，計數(shù)電路每計900個便向千位進1，在38000以上時，每計數(shù)1000個補充200個，即在38000以上，計數(shù)器每計數(shù)800個向千位進1。592.流式光散射檢測系統(tǒng)流式光散射檢測技術(shù)：由激光光源、檢測裝置和檢測器、放大器、甄別器、閾值調(diào)節(jié)器、檢測計數(shù)系統(tǒng)和自動補償裝置組成激光光源散射光檢測器光電倍增管熒光檢測器鞘流形式的裝置檢測裝置(三)血細胞檢測系統(tǒng)60(四)血紅蛋白測定系統(tǒng)

由光源、透鏡、流動比色池、濾光片和光電傳感器等組成。光源燈透鏡狹縫流動比色皿半透反射鏡濾光片540nm光電池樣品信號A濾光片690nm光電池參考信號B61(五)計算機控制系統(tǒng)①計算機中的微處理器(MPU)-中央處理單元(CPU)：算術(shù)邏輯部件、寄存器、控制部件、內(nèi)部總線、存儲器、輸入/輸出電路。輸入/輸出電路是CPU和外部設(shè)備之間交換信息的接口。②外部設(shè)備：顯示器、鍵盤、磁盤、打印機等。鍵盤通過控制電路與內(nèi)置電腦相連?？刂撇僮鞴δ苕I有：電源開關(guān)POWER樣品號鍵SAMPLE選擇鍵SELECT自動/手動選擇鍵AUTO/MANUAL重復(fù)鍵REPEAT計數(shù)鍵COUNT打印鍵PRNT進給鍵FEED輸入鍵ENTER清除鍵CLEAR清洗鍵CLEAN62四、血細胞分析儀的性能指標(biāo)與評價1.測試參數(shù)：16-46個不等2.細胞形態(tài)學(xué)分析：直方圖、WBC分類、幼稚細胞提示、RET計數(shù)分析。無論多么先進的血細胞分析儀，進行細胞分類都只是一種過篩手段，并不能完全取代人工鏡檢分類。（一）儀器的性能指標(biāo)P70結(jié)果異常、圖異常、儀器報警時要考慮人工復(fù)檢。633.測試速度：40-150個/小時4.樣本量：20-250ul

采血量夠、無凝塊、無棉纖維、無溶血等；EDTA-K2抗凝，儲存室溫2h內(nèi)；最好用真空采血管。5.工作條件與基本功能見表5-1P71環(huán)境溫度18-25℃。提供中文報告、異常報警、有與實驗室信息系統(tǒng)(LIS)鏈接功能。6.技術(shù)要求。見表5-2、3、4P71（一）儀器的性能指標(biāo)64（二）血細胞分析儀的評價1.精密度：

指重復(fù)測定中各次試驗結(jié)果彼此接近的程度。用高、中、低值新鮮全血各10份進行評價。用標(biāo)準(zhǔn)差(SD)或變異數(shù)(CV)表示。2.攜帶污染率：

指含量高的樣本對含量低的樣本所產(chǎn)生的影響。取高低2個樣品標(biāo)本，先測定高值樣品3次(H1,H2,H3)，隨時測定低值樣品3次(L1,L2,L3)。攜帶污染率=（L1-L3)/（H3-L3）×100％。P72653.總重復(fù)性：包括了重復(fù)測定的隨機誤差和攜帶污染雙重變異因素。隨機取標(biāo)本20份，常規(guī)分別測定即刻的RBC，WBC，Hb及放置2h，4h后的數(shù)值。分別測定RBC、WBC、Hb的重復(fù)試驗變異數(shù)(CV)。P72（二）血細胞分析儀的評價4.線性范圍：

是測試物濃度的變化與試驗結(jié)果成線性關(guān)系的一段。越寬越好。至少應(yīng)包括正常范圍及常見的病理范圍。665.白細胞分類的評價：①重復(fù)性：多次測定同一份血液能否得到非常近似的結(jié)果。②準(zhǔn)確性：與顯微鏡下分類結(jié)果的相關(guān)程度。

③對異常細胞的靈敏度：觀察外周血存在異常細胞，儀器是否能檢出。P72（二）血細胞分析儀的評價67（三）血細胞分析儀的校準(zhǔn)

出廠前已經(jīng)過廠方技術(shù)鑒定合格，但由于運輸振動或因故障維修后或長時間停用后再啟用等原因，以及正常使用半年以上或認為有必要時，都必須對儀器進行校準(zhǔn)及性能測試，這對了解儀器性能，發(fā)現(xiàn)問題，確保檢驗質(zhì)量有重要意義。

一般要求專人保養(yǎng)，按說明書要求用廠家的配套校準(zhǔn)物進行校準(zhǔn)。68五、血細胞分析儀的維護與常見故障排除（一）儀器的維護血細胞分析儀屬高精密儀器，應(yīng)有專人負責(zé)，按儀器廠家的的要求進行日保養(yǎng)、周保養(yǎng)、月保養(yǎng)及年終的大保養(yǎng)，并建立儀器保養(yǎng)和維修檔案。同時要做好：檢測器、液路和機械傳動部分的維護。(實驗課)691.檢測器的維護①采血順利；②防止纖維絲堵孔③計數(shù)期間，及時按“反沖”鍵，沖掉沉積變性的蛋白質(zhì)。檢測器④關(guān)機前對檢測器的微孔進行清理沖洗，并把其浸泡在清洗劑中。⑤定期卸下檢測器，用5%次氯酸鈉浸泡清洗。702.液路的維護五、血細胞分析儀的維護與常見故障排除使用含蛋白酶的清潔液浸泡一夜，再用稀釋液反復(fù)沖洗干凈管道后使用。儀器長期不用時，液路洗后，按數(shù)次計數(shù)鍵，充滿去離子水。稀釋液導(dǎo)管、清洗液導(dǎo)管、溶血劑導(dǎo)管等，防止細微雜質(zhì)引起的計數(shù)誤差。713.機械傳動部位的維護五、血細胞分析儀的維護與常見故障排除清理灰塵和污物，加潤滑油，防止機械疲勞和磨損。72（二）常見故障排除有自我診斷功能，有故障發(fā)生時，內(nèi)置電腦的錯誤檢查功能顯示出“錯誤信息”，并伴有報警聲。五、血細胞分析儀的維護與常見故障排除731.開機時的常見故障。

①開機指示燈及顯示屏不亮→檢查電路。②“RBC或WBC吸液錯誤”→提供稀釋液、正確連接進液管。2.測試過程中常見的錯誤信息

①“堵孔”：檢測器的微孔堵塞是影響檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性最常見的原因。常見原因：儀器長時間不用、棉纖維、抗凝不充分、蛋白沉積、灰塵等。主要處理方法：按CLEAN鍵清洗。②其他：“氣泡”、“流動比色池”、“噪聲”