第10章 紫外可見(jiàn)分光光度法

第10章

紫外-可見(jiàn)分光光度法河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李珺沬

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E-mail:smile0315@126.com10.1基本原理10.2紫外-可見(jiàn)吸收光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系10.3紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)10.4定性和定量分析方法10.5有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)研究簡(jiǎn)介光譜發(fā)展簡(jiǎn)史1665年，牛頓，揭示太陽(yáng)光是復(fù)合光1802年，渥拉斯登，發(fā)現(xiàn)太陽(yáng)光譜中的暗線1815年，夫瑯和費(fèi)，發(fā)現(xiàn)“夫瑯和費(fèi)”線1859年，本生、基爾霍夫，物質(zhì)發(fā)射光波長(zhǎng)與吸收光波長(zhǎng)一致密勒，將光譜圖由可見(jiàn)光區(qū)擴(kuò)展到紫外光區(qū)概述遠(yuǎn)紫外近紫外可見(jiàn)近紅外中紅外

遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5m2.5m~5.0m5.0m~1000m1.定義：研究物質(zhì)在紫外-可見(jiàn)光區(qū)分子吸收光譜的分

析方法。（電子光譜）靈敏度：10-4~10-6g/mL準(zhǔn)確度：0.5%2.應(yīng)用：定性：鑒別不同官能團(tuán)和化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的化合物；鑒別結(jié)構(gòu)相似的不同化合物。定量：?jiǎn)我唤M分的測(cè)定；多種混合組分不經(jīng)分離進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。10.1基本原理

10.1.1紫外-可見(jiàn)吸收光譜的產(chǎn)生及特征

1吸收峰：曲線上吸收最強(qiáng)的部位→最大吸收波（λmax）谷：峰與峰之間吸收最弱的部位→最小吸收波（λmin）肩峰：在吸收峰斜坡上的折點(diǎn)。末端吸收：在圖譜短波端只呈現(xiàn)強(qiáng)吸收而不成峰形的部位。強(qiáng)帶：εmax>104的吸收峰。弱帶：εmax<102的吸收峰。生色團(tuán)與助色團(tuán)生色團(tuán)：有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有重鍵，能在紫外-可見(jiàn)光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子基團(tuán)。簡(jiǎn)單的生色團(tuán)由雙鍵或叁鍵體系組成，如C＝C、C＝O、—NO2、偶氮基—N＝N—、乙炔基C≡C、腈基—C≡N、—C＝S等。

助色團(tuán)：有一些含有非鍵電子的雜原子飽和基團(tuán)(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X、—SR等)，它們本身沒(méi)有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當(dāng)它們與生色團(tuán)或飽和烴相連時(shí)，能使該生色團(tuán)或飽和烴的吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，并使吸收強(qiáng)度增加，這樣的基團(tuán)稱為助色團(tuán)。紅移與藍(lán)移由于化合物結(jié)構(gòu)的改變或受溶劑的影響，使吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)稱為紅移（長(zhǎng)移），向短波方向移動(dòng)稱為藍(lán)移(紫移)（短移）。增色效應(yīng)與減色效應(yīng)由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強(qiáng)度增加，稱為增（濃）色效應(yīng)，使吸收強(qiáng)度減小稱為減（淡）色效應(yīng)。

10.1.2Lambert-Beer定律(光吸收定律)吸光光度法的理論依據(jù)研究光吸收的最基本定律布格(Bouguer1729年)朗伯（1760年）定律：光吸收與溶液層厚度成正比比爾（1852年）定律：光吸收與溶液濃度成正比二者的結(jié)合稱為朗伯-比耳定律

1.Lambert-Beer定律：當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系。

數(shù)學(xué)表達(dá)：A＝-lgT=Ecl

A：吸光度，T：透光率，l：吸收池厚度，

c：溶液濃度，E：吸光系數(shù)注意：平行單色光均相介質(zhì)無(wú)發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)A=cl:摩爾吸光系數(shù)A=Eclc:mol/Lc:g/100mlA=cl

:百分吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)ε的討論吸收物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù)；不隨濃度c和光程長(zhǎng)度l的改變而改變。在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測(cè)物濃度無(wú)關(guān)；可作為定性鑒定的參數(shù)；同一吸收物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的ε值不同。在最大吸收波長(zhǎng)λmax處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。

εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測(cè)定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。εmax越大，表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測(cè)定該物質(zhì)的靈敏度越高。

ε=104~105：強(qiáng)吸收；ε<102

：弱吸收。Lambert-Beer定律吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測(cè)定的依據(jù)，應(yīng)用于各種光度法的吸收測(cè)量。Lambert-Beer定律的加合性A=Aa+Ab+Ac+……10.1.3偏離Beer定律的因素標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對(duì)Lambert-Beer定律的偏離。1.化學(xué)因素Lambert-Beer定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時(shí)才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10－2mol/L時(shí)，吸光質(zhì)點(diǎn)間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對(duì)光的吸收。故：Lambert-Beer定律只適用于稀溶液溶液中存在離解、締合、互變異構(gòu)、配合物形成等，使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

CrＯ42-+2H＋

=Cr2Ｏ72-+H2Ｏ溶液中CrＯ42-、Cr2Ｏ72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故：此時(shí)溶液pH對(duì)測(cè)定有重要影響。2.光學(xué)因素(1)非單色光E1=E2→A=EclE1<E2→吸光度增加→正偏差E1>E2→吸光度降低→負(fù)偏差譜帶寬度(2)雜散光不在譜帶寬度范圍內(nèi)(3)散射光和反射光

譜帶寬度范圍內(nèi)散射光：真溶液→空白對(duì)比補(bǔ)償渾濁溶液→A偏高反射光→A偏高(4)非平行光→A偏高3.透光率的測(cè)量誤差（1）暗噪聲光電檢測(cè)器或熱檢測(cè)器與放大電路等各部件的不確定性引起。（2）信號(hào)（散粒）噪聲分子軌道理論：一個(gè)成鍵軌道必定有一個(gè)相應(yīng)的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。10.2紫外-可見(jiàn)吸收光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系10.2.1電子的躍遷類型躍遷類型有機(jī)化合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，是其分子中外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果：σ電子、π電子、n（p）電子。軌道：電子圍繞分子或原子運(yùn)動(dòng)的概率分布。分子軌道：當(dāng)兩個(gè)原子靠近而結(jié)合成分子時(shí)，兩個(gè)原子的原子軌道線性組合生成兩個(gè)分子軌道。一個(gè)分子軌道具有低能量——成鍵軌道一個(gè)分子軌道具有高能量——反鍵軌道分子中n電子的能級(jí)，基本上保持原來(lái)原子狀態(tài)的能級(jí)——非鍵軌道（比成鍵軌道能級(jí)高，比反鍵軌道能級(jí)低）

當(dāng)外層電子吸收紫外或可見(jiàn)輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。有機(jī)化合物：σ→σ＊、π→π＊、n→σ＊、n→π＊、電荷遷移躍遷。無(wú)機(jī)化合物：電荷遷移躍遷、配位場(chǎng)躍遷。（1）σ→σ＊躍遷處于σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ＊反鍵軌道。

所需能量最大吸收光譜位于遠(yuǎn)紫外區(qū)(λ<150nm，真空紫外分光光度計(jì)檢測(cè))。例如：甲烷：λmax125nm，乙烷：λmax135nm。（2）π→π＊躍遷處于π成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到π＊反鍵軌道。所需能量較小吸收光譜處于遠(yuǎn)紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)強(qiáng)吸收，摩爾吸光系數(shù)ε>104例如：不飽和烴、共軛烯烴和芳香烴類。乙烯：λmax165nm，ε>104。共軛向長(zhǎng)波移動(dòng)：丁二烯：λmax217nm，ε=21000

（3）n→π＊躍遷含有雜原子不飽和基團(tuán)的化合物，其非鍵軌道中孤對(duì)電子吸收能量后，向π＊反鍵軌道躍遷。所需能量最低吸收波長(zhǎng)：200~400nm弱吸收，ε=

10～100分子中孤對(duì)電子和π鍵同時(shí)存在時(shí)發(fā)生n→π＊躍遷例如：丙酮：λmax為279nm，ε=

22（溶劑環(huán)己烷)。（4）n→σ＊躍遷含N、O、S和鹵素等雜原子基團(tuán)化合物，其雜原子中孤對(duì)電子吸收能量后向σ＊反鍵軌道躍遷。所需能量較大吸收光譜大部分在遠(yuǎn)紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察（吸收波長(zhǎng)為~200nm）例如：一氯甲烷：λmax173nm，甲醇：λmax183nm，三甲基胺：λmax227nm。10.2.2吸收帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系R帶由n→π＊躍遷引起的吸收帶，是雜原子不飽和基團(tuán)生色團(tuán)的特征。n*躍遷引起C=O、—NO2、—NO、—N=N—λ~300nm弱帶（

<100），濃溶液極性溶劑，吸收峰短移K帶相當(dāng)于共軛雙鍵中π→π＊躍遷所產(chǎn)生的吸收峰。*躍遷引起強(qiáng)帶（

>104）隨共軛系統(tǒng)延長(zhǎng)，*躍遷的吸收帶向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)B帶芳香族（包括雜芳香族）化合物特征吸收帶。*躍遷引起λ~256nm

~200在氣態(tài)或非極性溶劑中，苯及其許多同系物的B譜具有精細(xì)結(jié)構(gòu)（多重吸收帶）原因：振動(dòng)躍遷在基態(tài)電子上的躍遷上的疊加蒸氣：孤立分子震動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)溶液：部分振動(dòng)能力極性溶劑：不表現(xiàn)振動(dòng)光譜，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失E帶芳香族（包括雜芳香族）化合物特征吸收帶。*躍遷引起E1帶出現(xiàn)在180nm（=4.7×104）E2帶出現(xiàn)在200nm（

=7.0×105）當(dāng)苯環(huán)上有取代基時(shí)，苯的三個(gè)特征譜帶都會(huì)發(fā)生顯著的變化，其中影響較大的是E2帶和B帶。10.2.3影響吸收帶的因素位阻影響（1）結(jié)構(gòu)因素異構(gòu)現(xiàn)象跨環(huán)效應(yīng)在有些β-、γ-不飽和酮中，雖然雙鍵與酮基不產(chǎn)生共軛體系，但適當(dāng)?shù)亓Ⅲw排列，使羰基氧的孤電子對(duì)和雙鍵的電子發(fā)生作用，以致使相當(dāng)于n→π＊躍遷的R吸收帶向上波移動(dòng)。同時(shí)其吸收強(qiáng)度增強(qiáng)。基團(tuán)的π軌道與一個(gè)雜原子的p軌道有效交疊時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)跨環(huán)效應(yīng)（2）溶劑效應(yīng)改變?nèi)軇O性，引起吸收帶形狀的變化。非極性→極性，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，吸收帶變向平滑。改變?nèi)軇O性，吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生變化。

非極性→極性，π→π＊躍遷：長(zhǎng)波移動(dòng)；

n→π＊躍遷：短波移動(dòng)。溶劑選擇：（1）溶劑應(yīng)能很好地溶解被測(cè)試樣，溶劑對(duì)溶質(zhì)應(yīng)該是惰性的。即所成溶液應(yīng)具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性。（2）在溶解度允許的范圍內(nèi)，盡量選擇極性較小的溶劑。（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)應(yīng)無(wú)明顯吸收。（3）pH的影響酸性、中性、堿性都有明顯影響10.3

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)0.XXX光源單色器吸收池檢測(cè)器信號(hào)處理及顯示器I0It參比樣品未考慮吸收池和溶劑對(duì)光子的作用注意比較

A=lg(I0/It)＝lg(1/T)10.3.1主要部件1.光源

發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強(qiáng)度，穩(wěn)定，發(fā)光面積小，連續(xù)光譜。紫外區(qū)：氫燈，氘燈可見(jiàn)區(qū)：鎢燈，鹵鎢燈光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見(jiàn)，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見(jiàn)，近紅外氙燈180~1000紫外、可見(jiàn)（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段氙燈氫燈鎢燈2.單色器將光源發(fā)出的連續(xù)光譜按波長(zhǎng)順序色散，并從中分離出一定寬度譜帶的裝置。

①進(jìn)口狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)直鏡：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；④聚焦透鏡：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出口狹縫。棱鏡：玻璃350～3200nm，石英185～4000nm光柵：波長(zhǎng)范圍寬，色散均勻，分辨性能好，使用方便3.吸收池（比色皿）厚度(光程)：0.5,1,2,3,5…cm材質(zhì)：光學(xué)玻璃吸收池——可見(jiàn)光區(qū)熔融石英吸收池——可見(jiàn)、紫外光區(qū)匹配4.檢測(cè)器10.3.2光學(xué)性能與類型1.光學(xué)性能波長(zhǎng)范圍：195~820nm波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：顯示值與實(shí)際值之間的誤差≤±0.5nm波長(zhǎng)重現(xiàn)（復(fù)）性：≤0.5nm透光率測(cè)量范圍：0~150%（T）吸光度測(cè)量范圍：-0.1730~+2.00（A）光度準(zhǔn)確度：透光率滿量程誤差≤±0.5%光度重復(fù)性：重復(fù)測(cè)量透光率的變動(dòng)性≤±0.5%分辨率：?jiǎn)紊鞣直鎯蓷l靠近的譜線的能力。雜散光：以測(cè)光信號(hào)較弱的波長(zhǎng)處所含雜散光強(qiáng)度百分比為指標(biāo)。如：220nm處NaI≤±0.5%2.基本的光路類型（1）單光束分光光度計(jì)簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。（2）雙光束分光光度計(jì)自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。（3）二極管陣列檢測(cè)分光光度計(jì)由光源發(fā)出，色差聚光鏡聚焦后的多色光通過(guò)樣品池，再聚焦于多色儀的入口狹縫上。透過(guò)光經(jīng)全息柵表面色散并投射到二極管陣列檢測(cè)二極管陣列的電子系統(tǒng)。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)補(bǔ)充：分光光度計(jì)的校正1.波長(zhǎng)的校正F線（486.13nm）C線（656.28nm）可見(jiàn)光區(qū)紫外光區(qū)：苯蒸氣2.吸光度的校正硫酸銅、硫酸鈷銨、鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液3.吸收池的校正A:試樣溶液；B:參比溶液A:參比溶液；B:試樣溶液△A<1%AB10.4定性和定量分析方法10.4.1定性鑒別和純度檢測(cè)

定性鑒別的依據(jù)→吸收光譜的特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長(zhǎng)）吸收峰的強(qiáng)度相應(yīng)的吸光系數(shù)1.定性鑒別（1）對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)

（2）對(duì)比吸光度（或吸光系數(shù)）的比值

例：VB12（3）對(duì)比吸收光譜的一致性

將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品配成相同濃度的溶液，在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對(duì)其一致性。10.4.2純度檢測(cè)化合物無(wú)吸收，雜質(zhì)有較強(qiáng)吸收，少量雜質(zhì)可被檢測(cè)化合物有強(qiáng)吸收，雜質(zhì)弱吸收或無(wú)吸收，化合物吸光系數(shù)降低雜質(zhì)吸收強(qiáng)于化合物吸收，吸光系數(shù)增大雜質(zhì)有吸收，可使化合物吸收光譜變形（1）雜質(zhì)檢查（2）雜質(zhì)的限量檢測(cè)通常用峰谷吸收度的比值控制雜質(zhì)限量10.4.2單組分樣品的定量方法選擇吸收峰處，提高靈敏度，減少測(cè)量誤差選擇無(wú)其他物質(zhì)干擾，較高的吸收峰不選擇末端吸收溶劑不干擾被測(cè)組分的測(cè)定組分測(cè)定波長(zhǎng)大于溶劑的截止波長(zhǎng)1.吸光系數(shù)法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在測(cè)定條件相同條件下，分別測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-c

關(guān)系圖。在相同條件下，測(cè)出樣品溶液吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出樣品溶液的濃度。例如：蘆丁含量測(cè)定0.710mg/25mL3.對(duì)照法10.4.3計(jì)算分光光度法簡(jiǎn)介測(cè)量依據(jù)——吸光度的加和性：兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）

在處測(cè)定組分a,在處測(cè)組分b兩組分吸收光譜部分重疊

：測(cè)A1→b組分不干擾→可按單組分定量測(cè)兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測(cè)定1.解線性方程組法過(guò)程：2.雙波長(zhǎng)法3.導(dǎo)數(shù)光譜法10.4.4光電比色法1.顯色反應(yīng)及其條件顯色反應(yīng)：在可見(jiàn)分光光度法中，將試樣組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)。顯色劑：與被測(cè)組分化合生成有色物質(zhì)的試劑。

1）顯色反應(yīng)的要求：①被測(cè)物與生成有色物有確定的定量關(guān)系；②反應(yīng)產(chǎn)物有足夠穩(wěn)定性；③反應(yīng)產(chǎn)物與試劑顏色有明顯差別④反應(yīng)產(chǎn)物摩爾吸光系數(shù)足夠大，靈敏度高；⑤選擇性好。2）反應(yīng)條件的影響①溶劑與試劑用量、性質(zhì)吸光度A與顯色劑用量cR的關(guān)系會(huì)出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。②酸堿度在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對(duì)應(yīng)的pH范圍。緩沖溶液保持溶液pH③時(shí)間實(shí)驗(yàn)確定④溫度及其他3）反應(yīng)條件的控制2.測(cè)定方法各種類型的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和相應(yīng)的各種測(cè)定方法。10.5有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)研究簡(jiǎn)介10.5.1有機(jī)化合物的紫外吸收光譜1.飽和碳?xì)浠衔镏荒墚a(chǎn)生σ→σ*躍遷，吸收峰在真空紫外區(qū)2.含孤立助色團(tuán)和生色團(tuán)的飽和有機(jī)化合物當(dāng)飽和單鍵碳?xì)浠衔镏械臍湓颖谎?、氮、鹵素、硫等雜原子取代時(shí)，產(chǎn)生n→σ*躍遷、吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。通過(guò)共軛作用，形成大π鍵，吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)(紅移)，吸收強(qiáng)度也明顯增加。3.共軛烯烴均含有羰基，存在n、σ、π三種電子，能實(shí)現(xiàn)n→π*躍遷(270～300nm，ε=10~20)，n→σ*躍遷(180nm左右)和π→π*躍遷(150nm左右)。

4.α，β-不飽和羰基化合物α,β不飽和醛酮：

乙烯基π→π*躍遷吸收帶紅移至220～260nm，ε=104左右；羰基R帶紅移至310～350nm，ε＜1005.芳香族化合物(1)苯和取代苯苯：E1、E2、B吸收帶：π→π*躍遷極性溶劑中，B帶