質譜數(shù)據(jù)分析2012

從質譜數(shù)據(jù)鑒定多肽/蛋白質邵晨KeyadvantageofproteomicsResearchersworkonthelevelofgeneproductsanddealwithgenesthatarereallyexpressedtogiveadetectablePRODUCTandarenotjust"expressed“whichonlysaystheyproduceadetectablemRNAbutitisnotclearwhetherthereisageneproductornot.KeylimitationofproteomicsUsually,onlyafractionoftheproteinssynthesizedcanbedetectedinaproteomicsexperiment,whereastheexpressionofALLgenescanbemonitoredinawhole-genomearrayexperiment.KeyprerequisiteofproteomicsAgenomesequencefortheinvestigatedorganismoratleastacollectionofmanycDNAsequencesisrequired.Yogita

Mantri&Arvind

Gopu’spresentation,2003

把單個蛋白/多肽從復雜樣品中分離出來非常困難，在“組學”實驗中一般達不到這個效果MALDIm/zspectrumofapeptidemixtureThe

QuadrupoleThequadrupoleconsistsoffourparallelmetalrods.

Ionstraveldownthequadropoleinbetweentherods.

Onlyionsofacertainm/z

willreachthedetectorforagivenratioofvoltages:otherionshaveunstabletrajectoriesandwillcollidewiththerods.Thisallowsselectionofaparticularion,orscanningbyvaryingthevoltages.

sourcedetectorVoltageFiltersoutallm/zvaluesexcepttheonesitissettopassObtainsamassspectrumbysweepingacrosstheentiremassrangeCollectsandstoreionsinordertoperformMS-MSanalysesonthem.IonTrapMassAnalyzerTrappedionsIonsinIonsoutThetrapconsistsofatopandabottomelectrodeandaringelectrodearoundthemiddle.Ionsareejectedonthebasisoftheirm/zvalues.Tomonitortheionscomingfromthesource,thetrapcontinuoulsyrepeatsacylcleoffillingthetrapwithionsandscanningtheionsaccordingtotheirm/zvalues.Separatesthemassanalysisandionisolationeventsintime(usingasinglemassanalyzer)Ionizationiontransfer/trappingparentionisolation/fragmentationdaughteriondetectionAmassanalyzerfordeterminingthemass-to-chargeratio(m/z)

ofionsbasedonthecyclotronfrequencyoftheionsinafixedmagneticfield.Allionsaredetectedall

ions

are

detected

simultaneously

over

some

given

period

of

timeIonsareinjectedintoamagneticfield,thatcausesthemtotravelincircularpaths.ExcitationwithoscillatingelectricalfieldincreasestheradiusandenablesafrequencymeasurementFourierTransformMS

Fourier

transform

ion

cyclotron

resonance

mass

spectrometry,FTICMSICRcanbeusedwithdifferentionizationmethods,ESI,MALDIAshortsweepoffrequenciesisusedtoexciteallions.Thecomplexspectrumofintensity/timeisanalyzedwithFourierTransformtoextractthem/z

componetsHighresolutionHighaccuracyVerysensitive(theminimalquantityfordetectionisinorderofseveralhunderedionsNondestructive–theionsdon’thitthedetectionplatesotheycanbeselectedforfurtherfragmentationOrbitrap靜電軌道阱質譜傅里葉變換原理MassSpectrometryReviews，Volume27,Issue6講座大綱本講座中，將講述三種鑒定蛋白質的方法。1。質量紋鑒定法（PeptideMassFingerprinting）2。二級質譜的手工鑒定法（DenovoSequencing)。3。二級質譜的數(shù)據(jù)庫搜索鑒定法（MS/MSDatabaseSearching）。鑒定多肽的流程多肽混合物分離質譜儀一級質譜質量紋選擇高峰鑒定多肽質譜儀二級質譜手工鑒定數(shù)據(jù)庫搜索鑒定多肽多肽質量紋鑒定多肽質量紋（PeptideMassFingerprinting，PMF）是從一級質譜（MS）中鑒定多肽的主要方法。多肽質量紋一般都用于分析2DE-MS的結果，不適宜分析多個蛋白質的混合物。其原理就是利用了蛋白序列數(shù)據(jù)庫中的多肽質量的信息。一級質譜圖蛋白質經過酶解后，送入質譜儀，得到一級質譜。從一級質譜鑒定蛋白質的算法（質量紋）主要用在MALDI-TOF產生的質譜圖上。目前來說，由MALDI-TOF質譜儀產生的質譜圖精度較高。另一個問題是，ESI產生的質譜圖中的離子通常帶有很多電荷，而MALDI質譜圖中的離子一般只帶一個電荷，比較容易計算。蛋白序列數(shù)據(jù)庫在網(wǎng)上可以查詢到最新的蛋白序列數(shù)據(jù)庫，如IPI，swissprot等等下載FASTA格式ProteinsequencedatabaseUniprot（包含Swissprot和Tremble）Integr8FASTA格式的數(shù)據(jù)庫FASTA格式包含蛋白的名稱和氨基酸序列。虛擬酶解有了蛋白序列的信息，我們就可以進行鑒定。對應于送進質譜儀的樣品，首先找到數(shù)據(jù)庫里的序列的酶切位點。質量排列這樣可以產生一系列的多肽，我們可以計算每個多肽的分子量。最后一個R的質量多加了18，這是因為我們寫在下面的是殘基的分子量。質量排列把所有多肽的分子量排序。質量紋如此，質譜圖上的質量就可以與多肽上的質量相匹配。質量紋這就是多肽質量紋（PMF）的最基礎的思路。但是，真正的將之作為一個鑒定蛋白質的方法，還有很多需要考慮的問題。PMF中的問題第一個問題：質量相近的多肽怎么處理？在現(xiàn)實的蛋白數(shù)據(jù)庫中，多肽的數(shù)量是很龐大的。這里面難保不會有質量非常相近的多肽。這樣，就造成了質譜圖上的一個峰可能匹配不止一個多肽，于是我們就難以知曉這張質譜圖究竟代表哪個蛋白。質量相近的多肽多肽[M+H+]DGAPLESSSR1019.0490REGESTPSR1019.0520DFPIANGER1019.0940DPLASSSWR1019.0940YVPLKDQR1019.1800HLQLPAPSR1019.1830VLFLNGIDK1019.2200Peakm/z:1019.08解決方案第一個解決的辦法是限制用來搜索的數(shù)據(jù)庫。比如，你如果做的試驗用的是小鼠的組織，那么你可以只在小鼠的數(shù)據(jù)庫中搜索，這樣就可以減低出現(xiàn)這種情況的可能性。第二個解決的辦法是要求必須有多個多肽和數(shù)據(jù)庫相匹配，才做出最后的蛋白質鑒定。多匹配DFPIANGER 1019.09EPISVSSQQMLK 1347.56VLDALDSIK 974.13CarbonicanhydraseII

SHHWGYGKHBGPZHWHKDFPIANGERQSPVNIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVNNGHSFNVEYDDSQDKAVLKDGPLTGTYRLVQFHFHWGSSBBQGSEHTVDRKKYAAELHLVHWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPGSLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLMLANWRPAQPLKNRQVRGFPK多匹配可以大大降低隨機匹配的概率,從而增加結果的可信度長蛋白和短蛋白第二個問題：長蛋白可能會更容易的被匹配。因為長蛋白里的多肽數(shù)目較多，以概率來算，匹配上的幾率也會比較大。質量紋算法必須考慮這個問題，給短蛋白一定的補償。多個蛋白的情況第三個問題就是在一張質譜圖中可能有多個蛋白存在。通常，MALDI-TOF是與雙向電泳連接使用。雙向電泳的一個電泳點上可能有2-3個蛋白，這樣就增加了鑒定的難度。由于無法預知一個電泳點上有多少蛋白質，PMF的效果可能會受到很大的影響。多肽質量紋：小結質量紋算法是用一級質譜鑒定蛋白質的經典方法。質量紋算法的效果受到很多方面的限制，首先是儀器精度的限制，其次是樣品中可能有多個蛋白的限制。這使得質量紋算法不是理想的分析復雜混合物中蛋白成分的方法。講座大綱利用二級質譜圖我們剛才談到了，多肽質量紋有其先天的不足。其中，最糟糕的是它不能處理多個蛋白的混合物。如果我們能夠處理混合物，就可以減少很多用于純化上的時間和精力。那么，怎么才能從混合物中鑒定蛋白呢？這就要用到二級質譜。FromNesvizhskii’slectureatISB利用二級質譜圖在一級質譜圖中，選擇其中的一個峰（母離子），再把這個離子打碎（CID，ECD…），檢測碎片離子的m/z，就得到一張二級質譜圖。這里的假設是一級質譜中的一個峰就對應了一個多肽。FromJimmyEng’slectureatISB

MolCellProteomics.2011Nov;10(11):R111.009522.利用二級質譜圖對于一張一級質譜圖，可以選擇多個峰進行二級質譜的操作。這樣就可以適應樣品里有多個蛋白的情況。鑒定多肽的流程多肽混合物酶解分離質譜儀一級質譜質量紋選擇高峰鑒定多肽質譜儀二級質譜手工鑒定數(shù)據(jù)庫搜索鑒定多肽典型二級質譜圖CIDCID，即Collision-inducedDissociation，是通過撞擊使得多肽的肽鍵斷裂的過程。在做二級質譜的試驗時，質譜儀選擇一級質譜中的一個峰，也就是對應質荷比的這些離子，讓這些離子高速撞擊質譜儀中的惰性氣體，使其肽鍵斷裂，這就是CID。FromJimmyEng’slectureatISB

a,b,y系列離子最常見幻燈片57b1b2b3y1y2y3LFGKRelativeIntensitym/zFLGK++FLGK++FLGK++CIDFLGK++FLGK++FLGK++b1b2b3y3y2y1FLGK++FLGK+TheoreticalCIDofaTrypticPeptideKGLFMS/MSSpectrumParentions(464.29)DaughterionsNon-dissociatedParentions一些常見的特殊情況Neutralloss:某些酸性氨基酸可能會在CID中丟失一個水分子（H2O），而堿性氨基酸會在CID中丟失一個氨分子（NH3）。Immoniumions:氨基酸在CID過程中可能產生形如H2N=CHR+的Immoniumions（亞胺離子）。根據(jù)immoniumions可以判斷哪些氨基酸在多肽中存在。一些常見的特殊情況翻譯后修飾：有時，二級質譜中需要考慮某些氨基酸可能被修飾（磷酸化、糖基化等），這些修飾可能改變殘基的分子量。NeutralLoss和ImmoniumIons表AminoAcidNeutralLossImmoniumIonsA

44G

30S1860P

70V

72T1874C3476L/I

86N1787D1888Q17101K17101E18102M48104H

110F

120R17129Y

136W

159AminoAcidNeutralLossImmoniumIons通過二級質譜圖手工鑒定多肽序列九步鑒定法1。尋找immoniumions。2。尋找b2ion。3。尋找y1ion。4。尋找yn-1ion。5。順著yn-1,yn-2,…的順序繼續(xù)尋找y系列的離子。6。順著b2,b3,…的順序繼續(xù)尋找b系列的離子。九步鑒定法7。計算多肽的分子量。8。檢查鑒定的結果。9。試著解釋更多的峰。氨基酸質量速查表

注意我們給出的是殘基的分子量CodeResidueMassG57A71S87P97V99T101C103L/I113N114D115K/Q128E129M131H137F147R156Y163W186CodeResidueMassb2離子的m/z表

GASPVTCL/INDQ/KEMHFRYWG115

A129143

S145159175

P155169185195

V157171187197199

T159173189199201203

C161175191201203205207

L/I171185201211213215217227

N172186202212214216218228229

D173187203213215217219229230231

QK186200216226228230232242243244257

E187201217227229231233243244245258259

M189203219229231233235245246247260261263

H195209225235237239241251252253266267269275

F205219235245247249251260262263276277279285295

R214228244254256258260270271272285286288294304313

Y221235251261263265267277278279292293295301311320324

W244258274284286288290300301302315316318324334343347373例子M+2H=1295.0Da鑒定1。尋找Immoniumions：沒有找到。2。尋找b2ion：261.8。由于有234.0的a2ion和1033.3的yn-2ion，故肯定b2ion為261.8。3。尋找y1ion：由于已知多肽是由胰酶(Trypsin)酶解，故而C末端只能是K或R，所以雖然找不到y(tǒng)1ion，但是可以在1148.8處找到對應于K的bn-1ion。CID鑒定4。尋找yn-1ion：已經找到了。5。繼續(xù)尋找y系列的離子：從1033開始，可以分別找到934，748，633，532和461作為y系列的離子，把它們寫出來：鑒定6。繼續(xù)尋找b系列的離子：從834.9開始，似乎只有1019.7一個離子沒有鑒定了，它與1148.8之間形成一個氨基酸E，但與834.9之間相差185Da?？梢酝ㄟ^b2離子的m/z表查到對應的氨基酸序列：有AN,NA,QG,GQ四種序列都滿足185Da的條件(這樣用的時候注意要減1)。鑒定7。計算多肽的分子量：經計算，多肽的分子量約為1294.6Da，接近測得的分子量1295.0Da。8。檢查鑒定的結果：由于沒有觀測到immoniumions，我們暫時沒有輔助信息來幫助我們檢查這一鑒定結果。9。試著解釋更多的峰：發(fā)現(xiàn)817位置的峰是834位置的峰的neutralloss。De-novoSequencing這種僅通過殘基來鑒定多肽的方法又稱為De-novoSequencing?？梢杂糜嬎銠C程序使得鑒定問題自動化，計算機程序的鑒定流程與上面的九步鑒定法略有區(qū)別。當我們擁有近乎完美的二級質譜圖時，我們可以采用這種De-novoSequencing的辦法。但是，實際情況中，我們并沒有完美的二級質譜圖。我們已經從例子中看到，單從質譜圖不一定能得到全序列。返回DatabaseSearching實際情況中，單從質譜圖不一定能得到全序列。

但是，幸運的是，我們還有蛋白序列數(shù)據(jù)庫。所以我們可以從數(shù)據(jù)庫里搜索最好的匹配質譜圖的多肽，這樣就有了二級質譜的數(shù)據(jù)庫搜索算法。鑒定多肽的流程多肽混合物酶解分離質譜儀一級質譜質量紋選擇高峰鑒定多肽質譜儀二級質譜手工鑒定數(shù)據(jù)庫搜索鑒定多肽數(shù)據(jù)庫搜索的基礎數(shù)據(jù)庫搜索的基礎很簡單，就是理論質譜圖和實驗質譜圖之間的一個比對。我們剛才討論了CID的過程，所以我們知道了殘基產生的規(guī)律，那么，利用這些規(guī)律，我們可以對每個多肽產生一張理論的質譜圖，用來和試驗質譜圖進行比對，對它們“相似”的程度做一個評分，分數(shù)最高的多肽，我們就認為它是試驗質譜圖代表的多肽。數(shù)據(jù)庫搜索的流程在一個蛋白序列數(shù)據(jù)庫中，可以找出來的，落在質譜儀檢測范圍以內的多肽，多達數(shù)百至數(shù)千萬，如果每個多肽都拿來和實驗質譜圖做比對的話，需要花費的時間是難以接受的。提高搜索速度的關鍵就是減少搜索的對象數(shù)。數(shù)據(jù)庫搜索的流程所以，基本上，所有的數(shù)據(jù)庫搜索算法都包括兩個步驟。第一個步驟是篩選數(shù)據(jù)庫里的多肽，找出所有有可能與質譜圖匹配的多肽。第二個步驟就是拿這些選出來的多肽去和質譜圖進行比對，并輸出最高分值的多肽作為一個PSM（Peptide-SpectralMatch）。FromJimm