細胞自噬與神經(jīng)疾退行性疾病

細胞自噬

及其在神經(jīng)退行性疾病中的作用目錄神經(jīng)退行性疾病發(fā)生過程調(diào)控特點檢測基本概念細胞自噬ADPDHDAutophagy一詞來源于希臘語，auto指自身、phagy是吃的意思，autophagy意為自體吞噬，簡稱自噬。溶酶體基本概念自噬自噬是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，藉此實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，在細胞發(fā)育、細胞免疫、組織重塑及對環(huán)境適應(yīng)等方面有著十分重要的作用?；靖拍钭允勺允稍谶M化過程中高度保守，從酵母、果蠅到脊椎動物和人都可以找到參與自噬的同源基因。目前至少已經(jīng)鑒定出33種參與酵母自噬的特異性基因。其命名從最初稱為APG，AUT和CVT，現(xiàn)已被統(tǒng)一命名為酵母自噬相關(guān)基因ATG(autophagy-relatedgene，ATG)。哺乳動物自噬基因的命名和酵母相似，但也有個別差異，如酵母的ATG8在哺乳動物稱為LC3，酵母晦ATG6在哺乳動物則稱為Beclin1。基本概念自噬相關(guān)基因主要自噬相關(guān)蛋白（Atg）基本概念自噬相關(guān)蛋白分類根據(jù)其降解底物的特異性分類非選擇性自噬：隨機選擇性自噬：專一線粒體自噬(Mitophagy)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬(ER-phagy)過氧化物酶體自噬(Pexophagy)細胞核自噬(Nucleophagy)基本概念根據(jù)自噬的過程分類大自噬(Macroautophagy)—主要小自噬(Microautophagy):指溶酶體膜直接內(nèi)陷包裹底物并降解的過程。分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA):熱休克蛋白70(Hsp70)與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(AMP2A)基本概念分類分子伴侶介導(dǎo)的自噬小自噬大自噬基本概念分類自噬流自噬體自噬前體溶酶體自噬溶酶體起始延伸閉合成熟降解發(fā)生過程12345調(diào)控模式圖自噬上游調(diào)控自噬過程調(diào)節(jié)調(diào)控生理條件下,細胞自噬受到嚴格的調(diào)控?，F(xiàn)在了解得比較多的細胞自噬調(diào)控通路主要有兩條:mTOR通路和Ⅲ型PI3K通路。很多其他細胞自噬調(diào)控信號直接或間接的通過這兩條通路發(fā)揮作用。上游調(diào)控mTOR營養(yǎng)豐富mTOR被激活磷酸化Atg13與Atg1的結(jié)合能力降低Atg1的活性低與Atg17作用弱自噬水平低饑餓或雷帕霉素刺激mTOR被抑制反之.......自噬水平高在mTOR通路中，mTOR復(fù)合體通過與Atg13的作用，間接地影響了Atg1-Atg13-Atg17蛋白復(fù)合體的形成，進而影響了自噬水平的高低，Atg13在蛋白復(fù)合體中起到了介導(dǎo)作用。調(diào)控mTOR通路mTOR對細胞自噬起到負調(diào)控作用。在正常生長條件下,mTOR處于激活狀態(tài),細胞自噬受到抑制;當細胞處于饑餓或受到雷帕霉素刺激時,mTOR被抑制,細胞自噬被誘導(dǎo)增強。調(diào)控mTOR通路絲裂原刺激信號能量感受信號胰島素信號氨基酸信號p53通路調(diào)控PI3KⅢ通路Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3KⅢ)是一個正調(diào)控蛋白，它能夠磷酸化磷脂酰肌醇(PI),生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，而后PI3P利用胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成自噬體膜。PI3KⅢ也能與Beclin-1形成復(fù)合體，該復(fù)合物在自噬體形成的起始階段起重要作用。自噬過程調(diào)節(jié)起始:Atg1復(fù)合體膜的擴增與底物識別選擇:

Atg12-Atg5和Atg8分別泛素化修飾

自噬體成熟與降解自噬過程中的其他重要成員:分泌與內(nèi)吞途徑和細胞骨架調(diào)控調(diào)控自噬的調(diào)控泛素化修飾

調(diào)控雙重性：細胞存活&細胞死亡半衰期短：自噬體只能維持8min，與溶酶體融合，2h后自噬溶酶體基本降解消失保守性：自噬相關(guān)基因可誘發(fā)性：饑餓、微生物感染、缺氧、生長因子缺乏、放療、化療等條件都可以誘導(dǎo)自噬的活化批量降解：清除受損細胞器、錯誤折疊蛋白、冗余的蛋白以及代謝產(chǎn)物

特點1電鏡技術(shù)普通透射電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)2化學(xué)和免疫化學(xué)染色法基于自噬標記蛋白的檢測方法標記自噬溶酶體結(jié)構(gòu)的檢測技術(shù)檢測電鏡技術(shù)普通透射電鏡技術(shù)在超薄切片上可清晰地觀察到自噬結(jié)構(gòu)的形態(tài)和構(gòu)造，實驗指標包括細胞自噬水平和自噬結(jié)構(gòu)的變化，前者是指發(fā)生自噬的細胞出現(xiàn)率，后者以自噬細胞內(nèi)自噬結(jié)構(gòu)數(shù)目或自噬結(jié)構(gòu)與細胞質(zhì)的斷面面積之比衡量免疫電鏡技術(shù)可標記位于自噬前體和自噬體內(nèi)外膜上的LC3，該方法可用于鑒別自噬前體，自噬體和自噬溶酶體檢測檢測普通透射電鏡技術(shù)吞噬泡：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢自噬體：由包裹未吞噬降解的胞漿物質(zhì)、細胞器的雙層膜結(jié)構(gòu)組成。自噬溶酶體：由單層膜結(jié)構(gòu)組成，其中包裹著處于不同降解階段的胞漿成分。檢測普通透射電鏡技術(shù)檢測普通透射電鏡技術(shù)檢測普通透射電鏡技術(shù)化學(xué)和免疫化學(xué)染色法1基于自噬標記蛋白的檢測方法自噬體數(shù)量檢測—免疫熒光/組織化學(xué)技術(shù)蛋白表達量檢測—Western-blot2標記自噬溶酶體結(jié)構(gòu)的檢測技術(shù)單丹磺酸戊二胺（MDC）染色吖啶橙（AO）染色檢測自噬類別相關(guān)環(huán)節(jié)標志物大自噬自噬體的形成LC3(Atg8)Beclin1(Atg6)Atg5-Atg12Atg16LAtg9Atg14DRAM1ZFYVE1/DFCP1溶酶體LAMP-1LAMP-2自噬底物p62分子伴侶自噬LAMP2AHSC70線粒體自噬Atg32BNIP3自噬標記蛋白檢測檢測GFP-LC3指示技術(shù)陰性對照雷帕霉素處理NDV感染熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤HeLacells自噬的形成檢測GFP-LC3指示技術(shù)檢測免疫熒光染色-LC3B對照組氯奎處理組檢測WesternBlot標記自噬溶酶體結(jié)構(gòu)是以往應(yīng)用較為廣泛的活體檢測技術(shù)。MDC和AO是常用的嗜酸性染料，用于標記酸性細胞器。當溶酶體內(nèi)容物為酸性時，可獲得陽性染色信號。檢測染色技術(shù)檢測MDC染色自噬標志物的檢測在自噬研究中發(fā)揮了巨大的作用，使得人們可以簡便、動態(tài)、實時并定量地檢測細胞內(nèi)自噬水平。然而單獨檢測每一種自噬標志物都有一定的局限性和影響因素，在研究自噬時必須慎重考慮研究條件，適當設(shè)置陰性與陽性對照，使用多種自噬抑制劑或者基因沉默等技術(shù)，多方面、多層次進行實驗以確認細胞的自噬水平。檢測在該疾病的早期階段自噬起保護性作用，激活自噬可加速變性蛋白的清除來阻止疾病的進一步發(fā)展。然而，隨著疾病的進展，蛋白質(zhì)聚積物越來越多，對溶酶體蛋白酶降解的敏感性下降，自噬的持續(xù)性激活最終引發(fā)自噬性細胞死亡，這樣自噬又促進了神經(jīng)元的死亡。阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s）、亨廷頓氏?。℉untington’s）和帕金森氏?。≒arkinson’s）等神經(jīng)變性性疾病兩個最主要的特征是：胞漿中蛋白聚集物的存在和大的蛋白裂解體系活性的改變。神經(jīng)退行性疾病細胞自噬自噬的基本概念自噬的發(fā)生過程自噬的調(diào)控自噬的特