第九章 凝膠過濾層析及離子交換層析介質(zhì)20120328

第九章凝膠過濾及離子交換層析介質(zhì)

第一部分凝膠過濾層析

第一節(jié)概述凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography,GF或GFC）是20世紀(jì)50年代前后發(fā)展起來的一種按分子大小進(jìn)行分離的純化手段。在眾多分離計(jì)劃中被廣泛采用，不同的文獻(xiàn)中采用了多種不同的稱謂:凝膠層析（gelchromatography）排阻層析（exclusionchromatography）分子篩層析（molecularsievingchromatography）立體排阻層析（stericexclusionchromatography）體積排阻層析（sizeexclusionchromatography,SEC）凝膠過濾層析

第一節(jié)概述凝膠過濾具有的優(yōu)勢:（1）凝膠介質(zhì)不帶電荷，具有良好的穩(wěn)定性，分離條件溫和，回收率高，重現(xiàn)性好；（2）通常情況下，溶液中存在各種離子、小分子、去污劑、表面活性劑、蛋白變性劑等不會對分離產(chǎn)生影響，層析還能在不同pH、溫度下進(jìn)行；

（3）應(yīng)用范圍廣，能分離的物質(zhì)相對分子質(zhì)量的覆蓋面寬，從幾百到數(shù)百萬，因此既適用于分子量較低的寡糖、寡肽、聚核苷酸等生物小分子的分離，也適用于蛋白質(zhì)、多糖、核酸等大分子物質(zhì)的純化；（4）設(shè)備相對簡單、易于操作、分離周期短、連續(xù)分離時層析介質(zhì)不需再生即可反復(fù)使用。

凝膠過濾層析

第二節(jié)原理一、凝膠過濾的概念不同的溶質(zhì)因不同程度進(jìn)入介質(zhì)而在液相中停留的時間不同,凝膠的孔徑和溶質(zhì)分子大小的關(guān)系決定了層析時該溶質(zhì)在層析柱中的保留時間，不同的物質(zhì)因保留時間不同而分離.

凝膠過濾層析

第二節(jié)原理凝膠色譜分離原理凝膠過濾層析

第二節(jié)原理凝膠過濾分離蛋白質(zhì)的過程（1）蛋白質(zhì)混合物上柱；（2）開始洗脫，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，大分子蛋白質(zhì)被排阻在顆粒外；（3）小分子蛋白質(zhì)被滯留而移動慢，大分子蛋白質(zhì)移動快，大小不同的蛋白質(zhì)分子開始分開；（4）大小不同的蛋白質(zhì)分子完全分開；（5）大分子蛋白質(zhì)已被洗脫，而小分子蛋白質(zhì)仍在層析柱內(nèi)。凝膠過濾層析

第二節(jié)原理二、生物分子的相對分子質(zhì)量、分子大小和形狀每一種特定的凝膠介質(zhì)都有特定的分子量分級范圍，分級范圍是凝膠介質(zhì)的重要參數(shù)。根據(jù)其分級范圍，可以將溶質(zhì)分子分為三類：1.分子量大于分級范圍上限的分子被稱為全排阻分子，它們完全被排阻在凝膠顆粒網(wǎng)孔外，從顆粒間隙中通過，所受阻力最小，流程也最短，首先從層析柱中被洗脫下來；凝膠過濾層析

第二節(jié)原理2.分子量低于分級范圍下限的分子被稱為全滲透分子，它們完全進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)部，洗脫時所受阻力最大，流程也最長，最后從層析柱中被洗脫；3.分子量在分級范圍內(nèi)的分子被稱為部分滲透分子，它們依據(jù)分子大小不同程度的進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的，是該凝膠介質(zhì)的有效分離對象。如果兩種物質(zhì)分子量均大于凝膠介質(zhì)分級范圍的上限，或者均小于分級范圍下限，它們就無法通過層析而分離。凝膠過濾層析

第二節(jié)原理在生物大分子的分離中，決定該分子在層析時的保留時間長短即洗脫快慢的因素不僅僅是相對分子質(zhì)量，分子形狀的影響也很大。有著相同分子量，但是形狀不同的分子，其保留時間不同。一般來說，分子量相同情況下，不對稱程度增加會使分子更容易被阻擋在凝膠顆粒的網(wǎng)孔之外，導(dǎo)致保留時間變短。

凝膠過濾層析

第二節(jié)原理三、凝膠過濾的有關(guān)理論問題㈠凝膠介質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)和凝膠柱的體積參數(shù)凝膠過濾介質(zhì)是由多聚物交聯(lián)形成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的顆粒。凝膠柱的體積參數(shù)包括：總柱床體積（totalvolume,Vt），是凝膠經(jīng)溶脹、裝柱、沉降，體積穩(wěn)定后所占據(jù)層析柱內(nèi)的總體積；外水體積（outervolume,V0），是柱中凝膠顆粒間隙的液相體積的總和；內(nèi)水體積（innervolume,Vi），是存在于溶脹后的凝膠顆粒網(wǎng)孔中的液相體積的總和；凝膠體積（gelvolume,Vg），又稱支持物基質(zhì)體積（matrixvolumeofthesupport,Vs）或干膠體積，是凝膠顆粒固相所占據(jù)的體積，凝膠過濾層析

第二節(jié)原理根據(jù)凝膠床的組成，總柱床體積等于外水體積、內(nèi)水體積與凝膠體積之和：Vt=V0+Vi+Vg

凝膠柱體積參數(shù)示意圖凝膠過濾層析

第二節(jié)原理㈡洗脫體積和分配系數(shù)洗脫體積Ve定義為自樣品加至層析柱上部開始，至洗脫組分達(dá)到最大濃度（對映洗脫峰峰頂）時流經(jīng)層析柱的洗脫液的體積.

凝膠過濾層析

第二節(jié)原理凝膠過濾洗脫曲線示意圖（組分A為全排阻分子，組分B為部分滲透分子，組分C為全滲透分子）凝膠過濾層析

第二節(jié)原理所示層析圖譜中，樣品由三種組分組成。組分A為全排阻分子，分子量大于凝膠分級范圍上限，不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，經(jīng)凝膠顆粒間隙被洗脫，該組分的洗脫體積Ve等于外水體積V0（Ve=V0）。組分C為全滲透分子，分子量小于凝膠分級范圍下限，完全滲透進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，在正常洗脫條件下，與凝膠間不存在吸附作用時，此類組分的洗脫體積是最大的，等于外水體積V0與內(nèi)水體積Vi之和（Ve=V0+Vi）。組分B為部分滲透分子，分子量處于凝膠分級范圍內(nèi)，是此類凝膠能有效分離的物質(zhì)。根據(jù)組分B的分子量，該組分能以一定程度進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔之中，其洗脫體積Ve處于組分A與組分C之間（V0<Ve<V0+Vi）。凝膠過濾層析

第二節(jié)原理凝膠過濾層析是一種分配過程，凝膠顆粒內(nèi)部吸附的溶劑為固定相，流經(jīng)層析柱的洗脫劑為流動相，樣品的洗脫過程就是溶質(zhì)分子在兩相中不斷分配平衡的過程，而某種物質(zhì)的洗脫體積Ve的大小取決于該物質(zhì)在流動相和固定相之間的分配系數(shù)Kd，其關(guān)系式為：Ve=V0+Kd·Vi

Kd的值與被分離物質(zhì)的分子量和分子形狀、凝膠顆粒間隙和網(wǎng)孔大小有關(guān)，與層析柱的長短、粗細(xì)無關(guān)。凝膠過濾層析

第二節(jié)原理對所有全排阻分子，由于Ve相同，凝膠過濾層析時兩兩之間無法實(shí)現(xiàn)分離，對所有全滲透分子同樣如此。如兩種物質(zhì)都是部分滲透分子但分子大小不同，其Kd值不同因而Ve也不同，可實(shí)現(xiàn)分離，這種部分滲透分子之間的分離稱為分級分離。而不同類別分子之間，即在上圖中組分A與組分B，或組分A與組分C，或組分B與組分C之間的分離稱為組別分離。凝膠過濾層析

第二節(jié)原理當(dāng)凝膠與被分離組分存在相互作用的情況下會出現(xiàn)Kd>1的情況。這種相互作用包括：（1）疏水作用（2）親和作用（3）離子間的靜電作用

凝膠過濾層析

第二節(jié)原理㈢凝膠過濾的分辨率層析分離常采用分辨率（RS）來描述兩種物質(zhì)之間分離效果的好壞。分辨率定義為兩個洗脫峰峰頂對映的洗脫體積之差比上兩峰在基線上峰寬的和的平均值。式中，Ve1和Ve2——洗脫峰1和峰2的洗脫體積；Wb1和Wb2——洗脫峰1和峰2的峰寬。RS是相鄰兩個洗脫峰相對分離程度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。凝膠過濾層析

第二節(jié)原理分辨率Rs的定義凝膠過濾層析

第二節(jié)原理分離兩種物質(zhì)時分辨率取決于這兩種組分的洗脫體積和峰寬。而決定組分洗脫體積和峰寬的因素包括兩種組分的分子大小，凝膠柱的選擇性和柱效。選擇性是一個系統(tǒng)分離大小不同組分的能力，習(xí)慣用相對保留值來表示，定義為：=（Ve2－V0）/（Ve1－V0）Ve1和Ve2——組分1和組分2的洗脫體積；V0——層析柱的外水體積。凝膠過濾層析

第二節(jié)原理柱效用在特定實(shí)驗(yàn)條件下層析柱的理論塔板數(shù)N來表示通常表示為每米層析床所包含的理論塔板數(shù)，其計(jì)算公式：

Ve——組分的洗脫體積；Wh——洗脫峰半峰高（h1/2）時對映的峰寬。柱效還可用一個理論塔板的高度H來表示：H＝L/N式中L為柱長。凝膠過濾時柱效的好壞取決于層析柱的填充效果，凝膠顆粒的尺寸，柱長，流速等因素，良好的裝柱操作，較細(xì)的介質(zhì)，較長的層析柱都有利于提高柱效。凝膠過濾介質(zhì)的種類

⑴多糖類骨架的介質(zhì)：多糖類主要為纖維素，葡聚糖及瓊脂糖。這類介質(zhì)具有親水性及與生物大分子的相容性，可允許生物大分子透過而不發(fā)生變性。具有軟基質(zhì)，壓力降大，不易操作。四、凝膠過濾介質(zhì)的種類(2)合成大分子骨架的介質(zhì)吸取多糖類骨架親水性的優(yōu)點(diǎn)，克服其易受微生物侵襲的缺點(diǎn)，開展了合成有機(jī)小分子骨架的研究。選用高親水性單體，經(jīng)共聚反應(yīng)并控制孔結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一些合成骨架的介質(zhì)。（3）由天然大分子與合成高聚物構(gòu)成混合骨架的介質(zhì)：這種骨架既可增加介質(zhì)的剛性及抗微生物侵蝕性，又使介質(zhì)具有與生物大分子的相容性。凝膠過濾常作為下游的最終精細(xì)純化步驟，例如：肽，多糖，酶，重組蛋白，單抗及大蛋白。針對：樣品已純化部分。凝膠過濾操作，通常上樣量的體積越小，分辨率越高。凝膠過濾注意事項(xiàng)最終精細(xì)純化步驟：例如肽與酶蛋白。裝柱過程——不要分層。避免凝膠吸附生物大分子。選擇分離范圍與分子量接近的介質(zhì)。處理量大的樣品，選擇粒徑較大，流水速度快的介質(zhì)。處理量小，需要精細(xì)分離的樣品，選擇粒徑小且分辨率較高的介質(zhì)。四、凝膠過濾介質(zhì)的主要品種（一）葡聚糖系：葡聚糖凝膠是一種微網(wǎng)孔凝膠，在凝膠層析中使用最廣泛的一種層析介質(zhì)。商品名稱Sephadex.⑴結(jié)構(gòu)：Sephadex

是以氯代環(huán)丙烷進(jìn)行交聯(lián)的葡聚糖珠狀凝膠，交聯(lián)度影響凝膠的孔結(jié)構(gòu)，依據(jù)孔徑不同G型凝膠產(chǎn)品。G后面的數(shù)字為孔徑越大，排阻極限越大。G-10<700,G-25<1000-1500,G-200<5000-80000⑵性能：①溶脹性Sephadex系以干態(tài)供應(yīng)，使用之前需要溶脹（沸水浴加速溶脹）工作范圍：工作范圍（Mr)=(G-數(shù)目）X吸水量X10200X20X10=40000Sephadex是以氯代環(huán)氧丙烷交聯(lián)的葡聚糖珠狀凝膠。G后數(shù)子越大表示孔徑越大，排阻極限越大。②化學(xué)穩(wěn)定性：Sephadex不溶于一切溶劑，在水，鹽溶液，堿和弱酸溶液中均為較穩(wěn)定。因糖苷鍵在強(qiáng)酸中可發(fā)生降解作用所以只能接觸強(qiáng)酸的稀溶液。在0.1mol/L鹽酸中1-2h,在0.02mol/L鹽酸中經(jīng)6個月無明顯變化，要避免使用氧化劑。③物理穩(wěn)定性：pH中性濕態(tài)珠體可經(jīng)受120℃，30min高壓滅菌而不影響色譜性能。④機(jī)械強(qiáng)度：Sephadex凝膠的機(jī)械強(qiáng)度，取決于交聯(lián)度。高交聯(lián)度的凝膠為G15。G15為剛性，G25及G50也能承受一定的壓力。⑶主要用途：孔徑較小的凝膠（如G10，G15，G25，G50）主要用于脫鹽，肽與其他小分子的分離，孔徑較大的凝膠用于蛋白質(zhì)與其它大分子的分離。

DNA級的Sephadex適用于DNA或低聚核苷酸分離。⑷衍生系①SephadexLH系：在葡聚糖結(jié)構(gòu)中引入羥丙基就成為LH系列產(chǎn)品，以G-25為母體的衍生物為LH20，以G50為母體則為LH60，經(jīng)改性后LH系介質(zhì)具有更廣泛的用途，適用于脂類，甾類，脂肪類，激素，維生素及其它小分子的分級分離。

這類介質(zhì)除水溶液外，還適用用于極性有機(jī)溶劑及水有機(jī)溶劑的混合物中。②LH系列的主要用途用于有機(jī)溶劑中的凝膠過濾。廣泛用于吸附色譜及分配色譜：適合于其他凝膠難以處理的樣品。排阻極限與原母體凝膠相同。LH20對芳香多環(huán)化合物的吸附能力大于LH60，而LH60因?yàn)橛休^大的固定相體積而更適合于分配色譜。⑶SephasorbHPultrafine

該產(chǎn)品也是羥丙基化衍生物，交聯(lián)度極高，粒徑分布窄（10-23um),由于它的剛性及狹窄的粒徑范圍，使其即可用于中壓液相色譜，也可以用于HPLC；由于它的選擇性及惰性，使其廣泛用于（如醛，酮，酚和核苷酸等）分離，又因?yàn)橹械葮O性，所以可以用于正相色譜，也可以用于反相色譜。

HPLC----多肽及小分子中壓液相色譜----蛋白質(zhì)。

（二）瓊脂糖系瓊脂糖系凝膠都是經(jīng)過純化的瓊脂糖制備的，其中僅含有極少量的帶電荷基團(tuán)。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時可凝膠化的特點(diǎn)，可較為方便地制成珠狀物。在凝膠過程中先由單獨(dú)的多糖鏈形成雙螺旋，然后聚集成膠束。⑴Bio-GelA系：該產(chǎn)品由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，為非交聯(lián)瓊脂糖凝膠（使用溫度限制），受熱時，凝膠解體，使用溫度范圍2-30℃,適用pH范圍4-13。

⑵Sepharose系：①非膠聯(lián)結(jié)構(gòu)，不能高壓滅菌，僅限制2-40℃。根據(jù)瓊脂糖含量不同有3種型號，含量為2%,4%,6%的分別為2B，4B6B。

②SepharoseCL是瓊脂糖珠體與2，3-二溴丙醇反應(yīng)后具有共價(jià)交聯(lián)鍵的產(chǎn)物。交聯(lián)結(jié)構(gòu)大大提高了珠體的熱穩(wěn)定性及物理化學(xué)穩(wěn)定性，對孔結(jié)構(gòu)無明顯影響。交聯(lián)后的凝膠在還原條件下，經(jīng)堿水解后以去除硫酸根，減少常帶基團(tuán)。因此，這類介質(zhì)的非特異性吸附比其母體更小。這種凝膠在中性條件下可以經(jīng)120℃消毒，其色譜、性能不變，可以用離子交換及親和吸附劑的母體。

③Superose:由珠狀瓊脂糖兩次交聯(lián)而制備的新型凝膠為Superose.瓊脂糖先與含有雙環(huán)多氧基及多環(huán)氧基的混合長鏈交聯(lián)劑進(jìn)行第一階段交聯(lián)。然后，再與含有雙功能基的短鏈交聯(lián)劑進(jìn)行第二次交聯(lián)得到產(chǎn)品。經(jīng)兩次交聯(lián)后大大提高了介質(zhì)的剛性，并進(jìn)一步增加了其物理化學(xué)的穩(wěn)定性。用0.01mol/LHCl及0.1mol./LNaOH在40℃處理兩周，色譜性能無明顯變化，還可經(jīng)受70%甲酸處理。

Superose是適用于高流速的高效的高效凝膠過濾介質(zhì)，有Superose6及Superose12型號，其中含有瓊脂糖分別為6%和12%。⑶聚丙烯酰胺系：Bio-GelP是丙烯酰胺與N，N-亞甲基雙丙烯酰胺共聚而成的親水性凝膠，其中含有極少的游離電荷，羧基含量<3.0umol/g

干膠，因此，非特異吸附性很小。這類合成高聚物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不受微生物侵蝕，120℃消毒，30min不變性。改變交聯(lián)劑用量可控制不同孔徑，得到不同的排阻極限的系列產(chǎn)品。⑷Superdex系列產(chǎn)品：Superdex

是最新的凝膠過濾介質(zhì)，是將葡聚糖以共價(jià)結(jié)合到高交聯(lián)的多孔瓊脂糖珠體上，形成的復(fù)合凝膠。瓊脂糖的高交聯(lián)骨架為保持提供了較高的物理化學(xué)穩(wěn)定性，葡聚糖為介質(zhì)提供了良好的穩(wěn)定性。

特點(diǎn)：凝膠為剛性珠體，適合于高流速且分辯率較高，制備級分離效率可達(dá)到15000-3000塔板/米。粒徑24-44um的為制備級，均適用于HPLC系統(tǒng)。

極低的非特異性及極高的蛋白質(zhì)回收率。SuperdexPeptide優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性pH適應(yīng)范圍為1-14可在極性有機(jī)溶劑如70%乙腈水溶液中進(jìn)行分離。在70%甲酸溶液中分離疏水性的多肽，同樣也可以用于堿性溶液。⑸Toyopearl聚乙烯醇系：以交聯(lián)聚乙烯醇為骨架的凝膠過濾介質(zhì)。

Toyopearl為多孔的三向網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子鏈上含有豐富的羥基，骨架為高親水性，還可以進(jìn)行化學(xué)改造，而得到含有多種功能的離子交換劑及親和吸附劑的載體。該系統(tǒng)凝膠與生物大分子有相溶性，作為固定化生物催化劑已獲得廣泛應(yīng)用。

Toyopearl系的主要性能：①具有優(yōu)良的物理化學(xué)穩(wěn)定性，不溶于水及有機(jī)溶劑，不受微生物的侵蝕。

②由于該系列為合成高聚物，純度較高，大分子鏈中幾乎無帶基團(tuán)，其非特異性吸附可忽略不計(jì)，蛋白質(zhì)回收高。③該系為半剛性凝膠，適合于高流速，高生產(chǎn)效率的工業(yè)規(guī)模應(yīng)用，有較長的使用壽命，120℃反復(fù)消毒，色譜性能不受影響。

⑹Ultrogel系

UltrogelA是瓊脂糖凝膠，瓊脂糖含量為2%，4%，6%分別命名為A2，A4，A6。

Ultrogel

AcA是聚丙烯酰胺與瓊脂糖混合骨架的凝膠，它具有較窄的粒徑分布及孔徑分布，為剛性珠狀，具有優(yōu)良的化學(xué)物理穩(wěn)定性。⑺Bio-BeadS-X系(疏水性凝膠)

Bio-BeadS-X系列是美國BioRad公司的產(chǎn)品，為多孔苯乙烯-二乙烯苯共聚物。其適用于疏水性物質(zhì)及非水溶液。以二乙烯苯含量控制孔徑，但也受到洗脫劑的影響，在芳香族溶劑中其溶脹度大，排阻極限也增大，在醇類中，骨架不溶脹，孔徑小，排阻極限也小。多孔玻璃珠其他載體凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)一、凝膠過濾介質(zhì)的選擇㈠分離目標(biāo)和凝膠過濾介質(zhì)的特性根據(jù)分離樣品的數(shù)量和目的，生化分離過程分為分析型和制備型分離。分析型分離中樣品的量較少，分離目的包括目標(biāo)分子純度測定，分子量測定，分子量分布分析，獲取微量的目標(biāo)分子等。制備型分離涉及樣品的量相對較多，分離目的包括對樣品進(jìn)行脫鹽和緩沖液交換，去除混合物中的某些雜質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模的獲取目標(biāo)物質(zhì)，以及工業(yè)化制備某種物質(zhì)等。

凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)凝膠顆粒大小有粗、中、細(xì)、超細(xì)等，其顆粒直徑依次減小。一般情況下，粗規(guī)格的凝膠適合于對數(shù)量較多的樣品進(jìn)行分離，中規(guī)格的凝膠適合于少量、微量樣品的制備，常規(guī)分析和測定，而細(xì)和超細(xì)規(guī)格的凝膠則適合于微量和極微量樣品的分析。凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)為了成功地分離樣品，必須根據(jù)樣品特性和分離目的合理地設(shè)計(jì)出分離純化實(shí)驗(yàn)方案。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案時，應(yīng)當(dāng)考慮的因素主要包括凝膠過濾介質(zhì)或預(yù)裝柱的選擇，洗脫劑的選擇，層析柱尺寸的控制，以及層析過程中有關(guān)參數(shù)的確定。凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)㈡選擇性曲線和分離范圍待分離物質(zhì)的分子大小是決定選用何種介質(zhì)的最重要因素，絕大多數(shù)情況下，所選凝膠的分級范圍應(yīng)當(dāng)涵蓋目標(biāo)分子的大小。只有在這種情況下，介質(zhì)才能對目標(biāo)分子和其他大小不同的雜質(zhì)分子表現(xiàn)出不同的選擇性（α），從而進(jìn)行有效分離。凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)而凝膠的選擇性是由基質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)所決定的，與流動相無關(guān)，即凝膠過濾分離效果的好壞主要取決于介質(zhì)，因此介質(zhì)的選擇十分關(guān)鍵。凝膠介質(zhì)的選擇性曲線對于指導(dǎo)凝膠的選擇很有幫助。選擇性曲線是凝膠的重要參考指標(biāo)，一般是通過溶質(zhì)的有效分配系數(shù)Kav對溶質(zhì)的分子大小作圖得到。有時也可以用溶質(zhì)的洗脫體積Ve對分子大小作圖.

凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)㈢樣品和洗脫劑的特性在分子量相同的情況下，分子形狀不同的物質(zhì)分配系數(shù)和洗脫體積相差很大。每種介質(zhì)的選擇性曲線都有針對球狀蛋白和針對葡聚糖兩種，應(yīng)根據(jù)目標(biāo)分子的形狀更接近球狀蛋白還是線形的葡聚糖來確定其適合哪種選擇性曲線，進(jìn)而決定介質(zhì)類型。

在目標(biāo)分子的分子量或分子形狀未知的情況下，一般可以先選擇分級范圍較寬，有著較高排阻限的介質(zhì)來進(jìn)行分離.凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)二、洗脫劑的選擇

凝膠過濾層析中所用流動相即洗脫劑通常不對選擇性產(chǎn)生影響，從理論上講，如果所分離物質(zhì)不帶電荷，可以直接用蒸餾水進(jìn)行洗脫，實(shí)際操作時，當(dāng)對較大體積的樣品進(jìn)行脫鹽實(shí)驗(yàn)時，也的確有用蒸餾水洗脫的例子。然而絕大多數(shù)情況下人們考慮用緩沖液而不是蒸餾水來作為洗脫劑。凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)選擇緩沖液時首先要考慮的是在純化過程中維持合適的pH，在此pH下目標(biāo)分子穩(wěn)定性良好。大多數(shù)凝膠過濾在中性pH附近進(jìn)行，此時建議使用緩沖能力在pH6~8的水相緩沖系統(tǒng)，此環(huán)境對多數(shù)生物分子及介質(zhì)都是適宜的。有的凝膠介質(zhì)本身會帶有少量的負(fù)電荷，這會對按分子大小分離的凝膠過濾層析結(jié)果產(chǎn)生影響，為了排除這種影響，洗脫劑通常需要具有一定的離子強(qiáng)度，通常0.15mol/L的離子強(qiáng)度足以排除溶質(zhì)與介質(zhì)之間任何的離子作用。

凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)三、層析柱的選擇層析柱應(yīng)當(dāng)具有以下特點(diǎn)：（1）柱壁材料結(jié)實(shí)、化學(xué)惰性，能夠承受一定的操作壓力，在常規(guī)的層析條件下保持穩(wěn)定，不與樣品及洗脫劑發(fā)生相互作用；（2）層析柱的入口和出口部分的死體積盡可能小，低于柱體積的0.1%，這樣可以使樣品的稀釋程度最小化，同時防止已經(jīng)分離的樣品區(qū)帶在柱下端重新混合；

凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)（3）柱內(nèi)有設(shè)計(jì)合理的凝膠床支持物，既能有效的支撐凝膠床，又不易被堵塞，保證液流能夠均勻的通過；（4）容易拆卸，方便清洗，最好配件具有通用性。實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠過濾柱的內(nèi)徑大多在4~16mm，而柱長大多在25~100cm。

凝膠過濾層析

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)四、選擇預(yù)裝柱對于高分辨率凝膠介質(zhì)，其粒度往往較細(xì)，要獲得好的柱效填充技術(shù)非常重要。為了確保此類介質(zhì)的高分辨特性，很多公司將自己的部分層析介質(zhì)制成預(yù)裝柱后出售，由于采用了優(yōu)良的材料，合理的層析柱結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和良好的裝柱技術(shù)，這些層析柱在耐用性、清洗效果、柱效等很多方面要優(yōu)于自裝柱。當(dāng)然，其價(jià)格相對來說比零售介質(zhì)更貴。

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)

當(dāng)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)完成后，就需要著手對選擇好的凝膠介質(zhì)、層析柱、洗脫劑、樣品等進(jìn)行準(zhǔn)備，裝柱，平衡，加樣，洗脫，樣品檢測并收集，層析柱的清洗和再生，這些方面統(tǒng)稱為層析技術(shù)。凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)一、凝膠的準(zhǔn)備如果介質(zhì)是以已溶脹好的形式出售的，此類介質(zhì)一般也無需預(yù)處理，使用前靜置使介質(zhì)沉降，傾去上清液，按濕膠∶洗脫劑（v/v）=3∶1的比例添加洗脫劑，攪勻后即可裝柱。

如果介質(zhì)是以固態(tài)干膠形式出售的，在使用前需要進(jìn)行溶脹。溶脹是介質(zhì)顆粒吸水膨脹的過程，膨脹度（得水值）與基質(zhì)種類、交聯(lián)度及洗脫劑種類等有關(guān)。為了填充一根選定的層析柱需要稱取多少量的干膠是可以計(jì)算的：干膠用量（g）＝πr2h/膨脹度（床體積ml/g干膠）

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)二、裝柱㈠填充過程裝柱質(zhì)量的好壞直接影響到分離效果，填充得不好的層析柱會導(dǎo)致柱床內(nèi)液體流動不均勻，造成區(qū)帶擴(kuò)散，大大影響分辨率，也會對層析流速產(chǎn)生影響。

裝柱過程應(yīng)避免在通風(fēng)和日光直曬的環(huán)境中進(jìn)行，以防溫度改變造成層析柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。層析柱應(yīng)在支架上垂直放置。裝柱之前先用洗脫劑將層析柱底部死空間內(nèi)的空氣排空.

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)將已處理好的介質(zhì)放置在燒杯中，倒掉過多的液體，大致使得沉降介質(zhì)：上清液（v/v）=3∶1。介質(zhì)太稠在裝柱時容易有氣泡產(chǎn)生，而介質(zhì)太稀則很容易在柱中形成多個界面，造成很差的填充效果。將介質(zhì)懸液輕微攪拌混勻，利用玻棒引流盡可能一次性將介質(zhì)傾入層析柱，注意液體應(yīng)沿著柱內(nèi)壁流下，防止有氣泡產(chǎn)生.凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)㈡填充質(zhì)量的評估裝柱完成后，在進(jìn)行層析之前應(yīng)當(dāng)對裝柱情況進(jìn)行檢查，簡單的方法是將柱子對著亮光，利用透過光檢查柱床是否規(guī)整，是否有氣泡或界面存在。

也可以通過對有色物質(zhì)進(jìn)行層析并觀察區(qū)帶情況來實(shí)現(xiàn)，觀察有色區(qū)帶通過凝膠床時的變化情況可以檢驗(yàn)填充效果，填充良好的凝膠柱在洗脫時區(qū)帶保持均勻、平穩(wěn)的向下移動。

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)㈢柱的平衡

平衡的目的是為了確保層析柱中凝膠顆粒網(wǎng)孔和間隙中的液體與洗脫劑在組成、pH和離子強(qiáng)度等方面達(dá)到完全一致，這樣在加樣和洗脫過程中就能使待分離組分始終在所需的溶液環(huán)境中，有利于目標(biāo)分子活性的保持和層析行為的穩(wěn)定性。人們通常采用2~3個床體積的洗脫劑通過層析柱來確保其完全達(dá)到平衡。

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)三、樣品和洗脫劑的準(zhǔn)備洗脫劑配制時采用的試劑應(yīng)當(dāng)是分析純，而所用的水應(yīng)當(dāng)為純水。洗脫劑配制完畢在使用前，最好對其進(jìn)行過濾。層析前樣品如果是固體，可以將其溶于一定體積的洗脫劑中，如果是液體樣品，則可以直接加樣。為了延長介質(zhì)的使用壽命和保持高的分辨率，樣品中同樣必須無顆粒狀物質(zhì)存在。凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)樣品的黏度是影響上樣量和分離效果的一個重要方面.如果樣品黏度過高是由于濃度造成的，用洗脫劑或水稀釋樣品可以達(dá)到降低黏度的目的；如果黏度是樣品中核酸等雜質(zhì)引起的，可通過添加大分子聚陽離子化合物如聚乙酰亞胺或魚精蛋白硫酸鹽將其沉淀，或添加核酸內(nèi)切酶來降低黏度，但這些物質(zhì)無疑會成為額外的雜質(zhì)。如果樣品黏度非常高的話，也可以通過往洗脫劑中添加蔗糖或葡聚糖增加洗脫劑的黏度來補(bǔ)償。凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)四、加樣

當(dāng)層析柱準(zhǔn)備好且平衡完成，樣品和洗脫劑準(zhǔn)備完畢后,就可以開始加樣和洗脫了。加樣過程是將一定體積的樣品添加至層析柱頂端，并使其進(jìn)入凝膠柱。凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)㈠加樣量的選擇在進(jìn)行層析時樣品的添加量主要受分辨率的限制，因?yàn)榉直媛蔙s與樣品體積/柱體積之比有關(guān)，樣品體積/柱體積的比值增大會導(dǎo)致分辨率下降。對于分析型分離和難度比較大的分級分離，樣品體積/柱體積之比必須很小，此時加樣體積應(yīng)為床體積的0.5-5%,更小的加樣比例并不能進(jìn)一步改善分辨率。對于具體實(shí)驗(yàn)的加樣量，需根據(jù)樣品組成和性質(zhì)，凝膠介質(zhì)及想得到的分離程度來確定。

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)㈡加樣方法和注意事項(xiàng)加樣是將一定體積的樣品溶液添加至柱床的床面，依靠重力或泵提供的壓力使樣品進(jìn)入床面的過程。在加樣過程中樣品溶液應(yīng)盡可能均勻添加至床面，這樣在柱床的橫截面上樣品能夠均勻進(jìn)入，另外要防止液流破壞床面的平整性，否則會造成區(qū)帶形狀變差，洗脫峰變寬，從而對分辨率產(chǎn)生很大影響。凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)加樣的方法有多種，如果采用的是成套液相層析系統(tǒng)，一般都提供標(biāo)準(zhǔn)的加樣方法，如通過進(jìn)樣器或注射器等，最終利用泵將樣品溶液加入柱床。對于不帶有可調(diào)接頭的傳統(tǒng)填充柱，常見的加樣方法有排干法和液面下加樣法。凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)排干法是加樣前先將層析柱上口擰開，讓床面之上的液體靠重力作用自然排干，當(dāng)床面剛好暴露時將層析柱下端閥門關(guān)閉。閥門的關(guān)閉時機(jī)必須選擇恰當(dāng)，過早關(guān)閉床面上仍留有少量液體會對樣品產(chǎn)生稀釋作用，關(guān)閉過晚會導(dǎo)致床面變干。用吸管將樣品輕輕鋪加到床面上，注意不能破壞床面的平整，以免造成區(qū)帶的扭曲和傾斜，然后打開柱下端閥門，受重力作用樣品溶液進(jìn)入床面，當(dāng)樣品剛好完全進(jìn)入時關(guān)閉閥門。最后用洗脫劑充滿層析柱內(nèi)床面上端空間，擰緊層析柱上口，即可以用恒流泵泵入洗脫劑開始洗脫。

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)五、洗脫技術(shù)當(dāng)加樣完畢并且樣品進(jìn)入層析柱后，應(yīng)當(dāng)立即用洗脫劑對樣品進(jìn)行洗脫，以防樣品在層析柱中擴(kuò)散。通常洗脫過程以一個恒定的流速使洗脫劑通過層析柱，而這個恒定流速由靜水壓或者泵來控制。凝膠過濾層析時可采用的最大流速受到多種因素的限制，其中最為關(guān)鍵的因素是介質(zhì)的強(qiáng)度，流速不能超出該介質(zhì)的最大流速限制.凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)采用較大流速的情況出現(xiàn)在組別分離和大規(guī)模制備型分離時，前者由于很容易達(dá)到所需分辨率，采用高流速可有效縮短分離時間，后者對分離速度、生產(chǎn)效率有著比較高的要求，而對分辨率的要求相對較低，因此這兩種情況可在不超過介質(zhì)最大流速和背景壓的情況下盡量采用高流速。在分析型分離時對分辨率的要求較高，因此通常會采用相對較低的流速。

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)六、樣品的檢測、收集和處理樣品進(jìn)行層析時，各組分的分離情況，目標(biāo)分子的洗脫情況等都反映在層析圖譜中，在層析圖譜中，橫坐標(biāo)是時間或洗脫液體積，縱坐標(biāo)是檢測器的讀數(shù)。

根據(jù)樣品中組分性質(zhì)的不同，有多種不同的檢測器可供選擇。最常用的是紫外（UV）檢測器，可以在兩到三個固定的波長如280nm，254nm，214nm下測定洗脫液的吸光度.

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)一般來說人們需要獲得分離后的樣品，因此需要收集通過層析柱的洗脫液。對于最簡單的樣品分離，可以采用手工收集的方法，觀察到層析圖譜中出現(xiàn)洗脫峰時開始收集，到洗脫峰結(jié)束時終止收集。液相層析系統(tǒng)一般都配置了分部收集器來對樣品進(jìn)行收集。收集的模式可以有多種，常用的是按規(guī)定的時間或洗脫液體積進(jìn)行分部收集，也可根據(jù)檢測器檢測到的洗脫情況，按洗脫峰進(jìn)行收集。凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)七、凝膠過濾介質(zhì)的再生、清洗和貯存

理論上來說，在洗脫劑具有一定離子強(qiáng)度的情況下，樣品中所有組分都應(yīng)當(dāng)在一個柱體積內(nèi)被洗脫，當(dāng)洗脫液體積超過一個柱體積時洗脫即可停止.但實(shí)驗(yàn)中通常會使用1.5~2個柱體積的洗脫劑來完成洗脫過程。在清洗方法上，最為常規(guī)的是采用堿洗，根據(jù)介質(zhì)的pH穩(wěn)定范圍（短程）不同，用0.1~0.5mol/L的NaOH溶液對介質(zhì)進(jìn)行清洗除去污染物。

凝膠過濾層析

第三節(jié)層析技術(shù)浸泡在溶液中的層析柱和介質(zhì)在很少使用的情況下容易出現(xiàn)微生物生長的現(xiàn)象，尤其是葡聚糖和瓊脂糖類型的凝膠介質(zhì)，易于感染會分泌糖苷酶的微生物，導(dǎo)致基質(zhì)聚合物中的糖苷鍵降解而破壞了介質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，無論是層析柱還是介質(zhì)，在長期不使用時，不建議浸泡在對于微生物生長來說營養(yǎng)豐富的緩沖液如磷酸鹽緩沖液中，另外，在其浸泡的溶液中添加適當(dāng)?shù)囊志鷦┦潜仨毜?。凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例

凝膠過濾層析可以應(yīng)用于多種情況，例如對樣品進(jìn)行脫鹽和緩沖液交換，測定目標(biāo)分子的相對分子量，測定多聚物的分子量分布，測定親和過程的平衡常數(shù)，當(dāng)然還有對樣品進(jìn)行分析型或制備型的分離，等等。

凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例一、脫鹽脫鹽是指將鹽類等小分子物質(zhì)從樣品中除去,從而得到僅剩大分子物質(zhì)的樣品溶液.與透析法相比,凝膠過濾脫鹽具有樣品處理量大,操作時間短,不影響生物大分子活性等突出的優(yōu)點(diǎn)。脫鹽過程屬于組別分離,目標(biāo)分子和鹽類等在分子大小上存在很大的差異,很容易達(dá)到所需分辨率,因此對于介質(zhì)和層析柱的效率要求較低.選擇合適粒度的介質(zhì)，使層析過程的背景壓力較低,目標(biāo)分子在外水體積V0被洗脫,小分子在一個柱體積內(nèi)被完全洗脫,即能達(dá)到脫鹽要求。

凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例脫鹽過程的目的是為了除去樣品中的鹽類等小分子，當(dāng)然在此過程中人們不希望引入其他小分子雜質(zhì)，因此脫鹽時可以直接采用蒸餾水作為洗脫劑，以避免引入緩沖鹽等組分。脫鹽操作既可以在很小的規(guī)模上對微量樣品進(jìn)行，也可以在很大規(guī)模上進(jìn)行。

凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例

層析柱：85040mm

i.d.，介質(zhì)SephadexG-25，樣品：O，血紅蛋白；X，NaCl。加樣體積：A＝10ml，B＝400ml。用凝膠過濾對大體積樣品脫鹽

凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例三、相對分子質(zhì)量的測定凝膠過濾層析是常用的測定生物分子相對分子質(zhì)量的方法。與其他一些分子量測定方法如電泳技術(shù)相比，凝膠過濾法能夠在很寬的pH、離子強(qiáng)度、溫度范圍內(nèi)測定天然非變性條件下生物分子的分子量，并且測定過程較為簡單，不受目標(biāo)分子帶電狀態(tài)的限制，因而在實(shí)驗(yàn)室中被廣泛使用。凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例依據(jù)公式:凝膠過濾法測定分子量的基礎(chǔ)是公式Kav=a－blogMr即有效分配系數(shù)Kav與溶質(zhì)分子量的對數(shù)logMr之間線性關(guān)系，也就是介質(zhì)的選擇性曲線的線性部分。對于特定的凝膠柱，由于外水體積和柱體積是恒定不變的，根據(jù)公式可知，Kav=（Ve－V0）/（Vt－V0）在一定分子量范圍內(nèi)，洗脫體積Ve與logMr之間也存在線性關(guān)系。由于選擇性曲線是呈現(xiàn)S型的，在選擇性曲線的兩端，并不是理想的線性關(guān)系，因此在測定分子量時，目標(biāo)分子的有效分配系數(shù)必須滿足0.1<Kav<0.9，這也是所選介質(zhì)的工作范圍。凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例具體做法:利用上述線性關(guān)系，人們通過將幾種已知分子量的物質(zhì)加樣至層析柱，分別測出洗脫體積Ve，同時計(jì)算出這些分子相應(yīng)的logMr值，并以Ve對logMr作圖，即得到該層析柱的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在相同的條件下對需要測定分子量的物質(zhì)進(jìn)行層析，測出其Ve值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出該物質(zhì)的分子量。凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例凝膠過濾層析蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線

凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例五、混合物的分級分離㈢分離多糖多糖與蛋白質(zhì)、脂類形成的糖蛋白、脂多糖在細(xì)胞的識別、分泌以及在蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)移等方面起著不容忽視的作用。近20年來，人們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)多糖在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面具有重要的生物活性作用，因而糖生物學(xué)的研究逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，而在多糖的分離純化和分子量分布分析中，凝膠過濾層析的應(yīng)用也被廣泛地報(bào)道。凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例具體實(shí)例:從醫(yī)用真菌Phellinus

linteus的子實(shí)體中純化一種酸性蛋白聚糖的方法。首先通過熱水抽提、過濾、有機(jī)溶劑沉淀、透析和凍干等一系列過程得到粗多糖，然后用陰離子交換層析和凝膠過濾層析結(jié)合使用純化其中的酸性組分。

凝膠過濾層析

第四節(jié)應(yīng)用實(shí)例從Phellinus

linteus的子實(shí)體中提取的粗多糖中純化酸性蛋白聚糖

DEAE-纖維素離子交換層析，橫坐標(biāo)為分部收集時的分部號，縱坐標(biāo)O.D.值經(jīng)DNS顯色后測出；對離子交換后的活性分部進(jìn)行SepharoseCL-4B凝膠過濾層析，O.D.值經(jīng)DNS顯色后測出。第二部分離子交換層析

第一節(jié)概述離子交換層析（Ion-exchangechromatography，簡寫IEC）是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一。古代人們使用沙石來凈化飲用水就是利用了離子交換的原理;

目前，離子交換層析已成為蛋白質(zhì)分離純化中最常用的手段.離子交換層析

第一節(jié)概述離子交換層析具有特點(diǎn)：（1）分辨率高，（2）交換容量高，有利于放大分離規(guī)模和在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，（3）應(yīng)用靈活，（4）分離原理比較明確，（5）操作簡單易行，離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論一、離子交換基本原理

帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團(tuán)進(jìn)行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離。離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論離子交換色譜中所進(jìn)行的離子交換過程（以陽離子交換樹脂為例）離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論離子交換層析的本質(zhì):目的物與離子交換劑的結(jié)合能力首先取決于溶液pH，它決定了目的物的帶電狀態(tài)，此外還取決于溶液中離子的種類和離子強(qiáng)度。起始條件，溶液中離子強(qiáng)度較低，上樣后，目的物與交換劑之間結(jié)合能力更強(qiáng)，能取代離子而吸附到交換劑上；洗脫時，往往通過提高溶液的離子強(qiáng)度，增加了離子的競爭性結(jié)合能力，使得樣品從交換劑上解吸.離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論其它作用力：疏水相互作用和氫鍵.目的物與離子交換劑發(fā)生結(jié)合主要依靠相反電荷之間的離子鍵，但實(shí)際上此過程中還可能存在其它的作用力，常見的就是疏水相互作用和氫鍵。疏水相互作用主要出現(xiàn)在使用帶非極性骨架的離子交換劑時，例如聚苯乙烯樹脂.

氫鍵主要出現(xiàn)在使用以親水性高分子為骨架的離子交換劑，如以Sephadex或Sepharose為基質(zhì)的離子交換劑.離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論離子交換劑由水不溶性基質(zhì)和共價(jià)結(jié)合在基質(zhì)上的帶電功能基團(tuán)組成，帶電功能基團(tuán)上還結(jié)合有可移動的與功能基團(tuán)帶相反電荷的反離子（又稱平衡離子）。反離子可被帶同種電荷的其它離子取代而發(fā)生可逆的離子交換.離子交換劑的類型

離子交換劑的分類可以依據(jù)其基質(zhì)成分或功能基團(tuán)來進(jìn)行.按功能基團(tuán)分為強(qiáng)陽、強(qiáng)陰、弱陽、弱陰四種類型.按基質(zhì)構(gòu)成分為離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換瓊脂糖等。離子交換樹脂離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)帶有活性基團(tuán)的網(wǎng)狀高分子聚合物骨架活性基團(tuán)酚醛樹脂聚乙烯樹脂交聯(lián)劑酸性基團(tuán)堿性基團(tuán)—SO3H—COOH—N+R3—NR2Ionexchangeresins特殊基團(tuán)常見的離子交換功能基團(tuán)類型名稱英文符號功能基團(tuán)陰離子交換劑二乙基氨乙基DEAE－OCH2CH2N+H(C2H5)2季銨基乙基QAE－OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3季銨基Q－OCH2N+(CH3)3三乙基氨乙基TEAE－OCH2CH2N+(C2H5)3氨乙基AE－OCH2CH2NH3+陽離子交換劑羧甲基CM－OCH2COO－磺丙基SP－OCH2CH2CH2SO3－磺甲基S－OCH2SO3－磷酸基P－OPO3H2Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead106Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----107Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--108Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++109Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------110

離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論1．上樣階段，此時離子交換劑與平衡離子結(jié)合；（平衡階段）2．吸附階段，混合樣品中的分子與離子交換劑結(jié)合；3．開始解吸階段，雜質(zhì)分子與離子交換劑之間結(jié)合較弱而先被洗脫，目標(biāo)分子仍處于吸附狀態(tài)；4．完全解吸階段，目標(biāo)分子被洗脫；5．再生階段，用起始緩沖液重新平衡層析柱，以備下次使用。離子交換層析一般步驟離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論無機(jī)離子與交換劑的結(jié)合能力與離子所帶電荷成正比，與該離子形成的水合離子半徑成反比。也就是說，離子的價(jià)態(tài)越高，結(jié)合力越強(qiáng)，價(jià)態(tài)相同時，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越強(qiáng)。在陽離子交換劑上，結(jié)合力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篖i+<Na+<K+<Rb+<Cs+Mg2+<Ca2+<Sr2+<Ba2+Na+<Ca2+<Al3+<Ti4+在陰離子交換劑上，結(jié)合力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篎-－<Cl－-－<Br－-－<I－-－

離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論離子交換的分辨率離子交換的效果常用兩個目標(biāo)峰的分辨率（RS）來描述。分辨率定義為兩個洗脫峰峰頂對映的洗脫體積之差比上兩峰在基線上峰寬的和的平均值。式中，VR1和VR2——洗脫峰1和峰2的洗脫體積；Wb1和Wb2——洗脫峰1和峰2的峰寬。洗脫體積和峰寬應(yīng)使用相同的體積單位表示。離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論RS是相鄰兩個洗脫峰相對分離程度的衡量標(biāo)準(zhǔn).假設(shè)兩個相鄰洗脫峰面積相等，RS＝1.0時，兩峰實(shí)現(xiàn)主體分離；若達(dá)到完全分離，要求RS≥1.5。需指出的是，一個完全分離的洗脫峰在很多時候并不意味著是單一組分，當(dāng)分離參數(shù)改變后，往往又能分開成為若干個峰。不同分辨率下的分離效果

離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論一個純化系統(tǒng)能夠達(dá)到的分辨率取決于該系統(tǒng)的選擇性、效率和容量，這是柱層析中的三個最重要的參數(shù)。RS的解析表達(dá)式為：㈠容量因子一般來說，容量因子k’的取值與可交換分子在固定相（離子交換劑）和流動相（緩沖液）中的分配性質(zhì)、層析溫度及固定相和流動相的體積比有關(guān)，而與柱尺寸和流速無關(guān)。

離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論㈡柱效率柱效率用在特定實(shí)驗(yàn)條件下層析柱的理論塔板數(shù)N來表示，通常表示為每米層析床所包含的理論塔板數(shù).柱效率下降會導(dǎo)致層析時區(qū)帶變寬，也就是洗脫峰的峰寬變大。

離子交換層析

第二節(jié)相關(guān)理論㈢選擇性選擇性是一個系統(tǒng)分離不同蛋白峰的能力，習(xí)慣用相對保留值α來表示，從對分辨率的影響上來看，好的選擇性往往比高的柱效率更為重要.離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)一、離子交換劑的選擇二、緩沖液的選擇和層析條件的確定三、層析柱的尺寸四、離子交換劑的準(zhǔn)備五、樣品的準(zhǔn)備六、加樣七、洗脫技術(shù)離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)在選擇了采用離子交換技術(shù)后，要想獲得好的分離效果，需要考慮的問題包括：1.分離的規(guī)模有多大，采用何種分離模式；2.選用什么樣的離子交換劑；3.何種規(guī)格的層析柱；4.選用何種緩沖液，起始條件如何確定；5.采用何種方法洗脫等。只有在這些問題都得到解決之后，才能設(shè)計(jì)出初步的實(shí)驗(yàn)方案并付諸實(shí)施。離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)1.分離的規(guī)模有多大，采用何種分離模式

關(guān)于分離的規(guī)模和選用的模式。對于分析型分離和實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備型分離，一般采用常規(guī)的柱層析技術(shù)；而對于大規(guī)模工業(yè)化分離，可以有柱層析、膨脹床吸附、分批分離等多種模式可供選擇。

離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)2.離子交換劑的選擇為了能滿足快速分離的要求，所選擇的介質(zhì)應(yīng)當(dāng)能夠在承受高的流速的前提下有著較低的背景壓力。由于樣品的數(shù)量大，高的有效交換容量是必需的，因此介質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有大孔型的結(jié)構(gòu)和較高的取代程度。此外，該介質(zhì)還必須能夠滿足原位清洗（CIP）的要求，對于大規(guī)模的層析柱，每次分離后將介質(zhì)倒出清洗和再生，然后重新裝柱將是難以想象的。離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)3.緩沖液的選擇和層析條件的確定作為固定相的離子交換劑選擇好以后，還需要確定作為流動相的緩沖液，這里包括緩沖物質(zhì)的種類，起始緩沖液的pH和離子強(qiáng)度，極限緩沖液的pH和離子強(qiáng)度等。離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)一般的原則是，進(jìn)行陽離子交換時，選用緩沖離子為陰離子的緩沖物質(zhì)；進(jìn)行陰離子交換時，選用緩沖離子為陽離子的緩沖物質(zhì)。當(dāng)然這并不是絕對的，但是當(dāng)選用的緩沖離子與功能基團(tuán)帶相反電荷時，應(yīng)特別注意在上樣前確保層析系統(tǒng)與起始緩沖液之間在pH和離子強(qiáng)度上都達(dá)到平衡。在此前提下，選用何種類型的緩沖物質(zhì)取決于層析時的pH條件，后者又與目的物的等電點(diǎn)有關(guān)。確定了起始pH以后，根據(jù)緩沖物質(zhì)的pKa值，選用pKa與起始pH很接近的物質(zhì)作為緩沖成分。

離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)以上確定緩沖液的方法是建立在目的物的等電點(diǎn)已知的基礎(chǔ)上的，但在更多情況下，人們對目的物的性質(zhì)未必清楚，此時緩沖液及起始pH的確定可以通過試管小試法確定.

離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)具體操作如下：（1）準(zhǔn)備10支15ml試管；（2）每管加入0.1g基于交聯(lián)葡聚糖的離子交換劑或1.5ml基于瓊脂糖或纖維素的離子交換劑；（3）配制一系列濃度為0.5mol/L的不同pH的緩沖液，相鄰兩種緩沖液的pH相差0.5個單位，如果使用陰離子交換劑，這個系列的緩沖液pH分布在5～9，如果使用陽離子交換劑，這個系列的緩沖液pH分布在4～8;離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)（4）各取10ml上述不同pH的緩沖液分別加入10支試管中用以平衡交換劑，混合一段時間后棄去上清液，再分別加入10ml新鮮緩沖液，反復(fù)10次后可以使試管內(nèi)的交換劑在pH上完全與緩沖液達(dá)到平衡;（5）再用10ml低濃度的同一pH的緩沖液洗滌各試管中的交換劑，反復(fù)5次可確保試管內(nèi)的交換劑在離子強(qiáng)度方面與起始緩沖液保持一致；（6）各支試管中加入相同數(shù)量的樣品，混合放置5～

10min；（7）使離子交換劑沉降，分析上清液中目的物含量，結(jié)果如圖所示。離子交換層析

第三節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)試管法確定起始pH和離子強(qiáng)度A．確定起始pH為7.0；B．確定起始鹽濃度為0.15mol/L，洗脫鹽濃度為0.3mol/LAB離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)確定起始緩沖液的離子強(qiáng)度時，多數(shù)情況下人們直接采用由緩沖物質(zhì)提供離子強(qiáng)度的方法，即不額外往緩沖液中添加非緩沖鹽，緩沖物質(zhì)的濃度（一般為0.02～0.05mol/L）決定了離子強(qiáng)度，只要起始pH選擇合適，在此離子強(qiáng)度下目的物完成能夠與交換劑結(jié)合。另外，多數(shù)情況下在完成吸附后，人們通過增加洗脫液離子強(qiáng)度的方式將目標(biāo)蛋白從層析柱上洗脫下來，洗脫緩沖液就是由起始緩沖液添加特定濃度的非緩沖鹽組成，而非緩沖鹽所需的濃度同樣可以通過試管小試法確定。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)選擇緩沖液時除了考慮緩沖物質(zhì)成分、pH和離子強(qiáng)度外,有時還需要注意其它一些問題。當(dāng)離子交換后的洗脫組分需要進(jìn)行冷凍干燥時，應(yīng)考慮選用揮發(fā)性的緩沖物質(zhì)，以盡可能少的將雜質(zhì)成分帶入最終產(chǎn)品中。如果是大規(guī)模工業(yè)化分離，緩沖液的用量往往是非常大的，緩沖物質(zhì)的價(jià)格也是必須考慮的問題，應(yīng)當(dāng)在pKa值相近的幾種緩沖物質(zhì)中選用最廉價(jià)的。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)在有些情況下，離子交換的緩沖液中還會添加一些其它的化合物，其作用主要有：增加目的物的溶解度、提高層析分辨率、保護(hù)待分離物質(zhì)等。離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)三、層析柱的尺寸離子交換層析通常選用短的層析柱，即高徑比小的層析柱,典型的離子交換柱高度在5～20cm，高徑比一般小于5。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)四、離子交換劑的準(zhǔn)備

選擇好離子交換劑后，進(jìn)行離子交換層析前，必須先將離子交換劑準(zhǔn)備好，這包括離子交換劑的預(yù)溶脹和清洗、裝柱以及用起始緩沖液平衡層析柱直至流出液在pH和離子強(qiáng)度方面與起始緩沖液一致。離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈠離子交換劑的預(yù)處理Source系列、MonoBeads系列和MiniBeads系列等細(xì)顆粒介質(zhì)通常產(chǎn)品供應(yīng)商已經(jīng)將其制成預(yù)裝柱出售，使用前不需預(yù)處理，直接用起始緩沖液平衡后即可加樣。基于瓊脂糖的Sepharose系列和Bio-GelA系列離子交換劑，以及DEAE-Sephacel交換劑是以液態(tài)濕膠形式出售的，一般也無需預(yù)處理，使用前傾去上清液，按濕膠∶緩沖液（v/v）＝3∶1的比例添加起始緩沖液，攪勻后即可裝柱。離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)基于Sephadex的離子交換劑以固態(tài)干膠形式出售，使用前需要進(jìn)行溶脹。溶脹過程通常應(yīng)將交換劑放置在起始緩沖液中進(jìn)行，完全溶脹在常溫下需1～2天，在沸水浴中需2個小時左右，而且在高溫下溶脹還能起到脫氣的作用。在溶脹過程中應(yīng)避免強(qiáng)烈攪拌.基于纖維素的離子交換劑也是以干態(tài)形式出售的，使用前需要進(jìn)行溶脹。也需要先傾泌除去細(xì)的顆粒，然后用酸堿輪流洗滌，洗滌時所使用的酸堿濃度大于纖維素交換劑，一般可用2mol/L的NaOH和HCl進(jìn)行處理。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈡裝柱裝柱是層析技術(shù)的一個重要環(huán)節(jié)，裝柱質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到分離效果.裝柱之前首先用緩沖液將層析柱底部死空間內(nèi)的空氣排空，將預(yù)處理好的離子交換劑放置在燒杯中，傾去過多的液體，大致使得交換劑∶上清液（v/v）=3∶1，輕微攪拌混勻，利用玻棒引流盡可能一次性將介質(zhì)傾入層析柱，注意液體應(yīng)沿著柱內(nèi)壁流下，防止有氣泡產(chǎn)生.

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈢選擇預(yù)裝柱

很多公司將自己的層析介質(zhì)制成預(yù)裝柱后出售，由于采用了優(yōu)良的材料，合理的層析柱結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和良好的裝柱技術(shù)，這些層析柱在耐用性、清洗效果、柱效率等很多方面要優(yōu)于自裝柱。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈣柱的平衡平衡過程的目的是為了確保離子交換劑上的功能基團(tuán)與起始緩沖液中的平衡離子間達(dá)到吸附平衡。判斷層析柱是否已經(jīng)達(dá)到平衡是通過檢驗(yàn)柱下端流出的洗脫液與起始緩沖液在pH、電導(dǎo)和離子強(qiáng)度方面是否達(dá)到一致，由于在這幾個指標(biāo)中通常pH最難達(dá)到平衡，所以往往檢測洗脫液的pH即可。對于一些弱型離子交換劑，由于本身具有一定的緩沖能力，直接用起始緩沖液是很難將其平衡至起始pH的，此類交換劑在裝柱前就應(yīng)當(dāng)用酸或堿將其pH先調(diào)節(jié)至起始pH，裝柱后再用起始緩沖液進(jìn)行平衡。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)五、樣品的準(zhǔn)備

在任何形式的層析中，樣品中必須無顆粒狀物質(zhì)存在,因此混濁的樣品在上柱前必須通過過濾或離心除去顆粒狀物質(zhì)。離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)樣品的粘度是影響上樣量和分離效果的一個重要方面，如果樣品粘度過大是由于濃度過大造成的，那么用起始緩沖液稀釋樣品可以達(dá)到降低粘度的目的；如果粘度是由樣品中存在的核酸等雜質(zhì)引起的，可以通過添加大分子聚陽離子化合物如聚乙酰亞胺或魚精蛋白硫酸鹽將其沉淀，或者添加核酸內(nèi)切酶來降低粘度，但這些物質(zhì)的添加無疑會引入額外的雜質(zhì)，在后續(xù)分離中必須將其除去。在離子交換層析上樣前必須確保樣品溶液在pH和離子強(qiáng)度方面與起始緩沖液是一致的，這樣才能保證在起始條件下目的物能吸附在離子交換劑上

.離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)六、加樣㈠.加樣量的選擇理論上，將所使用的離子交換劑的有效交換容量乘上層析柱柱床的體積就可以計(jì)算出最大加樣量,但事實(shí)上有效交換容量并不是常數(shù).因此，在離子交換層析中為了獲得理想的分離效果，建議加樣時樣品中目的物的含量不應(yīng)超過其有效交換容量的10～20％。

實(shí)踐中有時目的物的含量是未知的，可以通過試管小試法來確定最大加樣量。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)具體的操作:在10支試管中分別加入相同數(shù)量的離子交換劑，用起始緩沖液充分洗滌、平衡，然后往10支試管中分別加入數(shù)量遞增的樣品溶液，相鄰兩支試管間加樣量的差值是恒定的，充分混合完成吸附，分析上清液中目的物的含量，上清液中不含目的物而加樣最多的試管對應(yīng)的加樣量即為試管條件下的最大加樣量，根據(jù)試管內(nèi)以及層析柱床離子交換劑的體積可以計(jì)算出層析條件下的最大加樣量。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈡加樣方法和注意事項(xiàng)在加樣過程中樣品溶液應(yīng)盡可能均勻的添加至床面，防止液流破壞床面的平整性，否則會造成區(qū)帶形狀變差，洗脫峰變寬。

常見的加樣方法有排干法和液面下加樣法。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)七、洗脫技術(shù)多數(shù)情況下，在完成了加樣吸附和洗滌過程后，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)從層析柱中被洗去，然后需要改變洗脫條件，使起始條件下發(fā)生吸附的目的物從離子交換劑上解吸而洗脫.離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈠洗脫機(jī)制溶質(zhì)在柱上吸附或交換的量的多少，我們可用吸附平衡常數(shù)或稱為分布系數(shù)α來表示，其定義可用數(shù)學(xué)式表示為：α＝被吸附的某溶質(zhì)量/某溶質(zhì)總量＝固定相/（動相+定相）吸附平衡常數(shù)α的取值在0～1之間，不同α值下，溶質(zhì)的吸附強(qiáng)度不同，被洗脫的難易程度也會出現(xiàn)變化。若α=0，溶質(zhì)沒被吸附，可能不帶電或帶相同電荷，在一個柱體積被洗脫，在柱中移動速度等于緩沖液的液速，有：Ve==Vt離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)若α=1或接近1，目的物可被完全吸附或幾乎完全吸附，溶質(zhì)的動速等于0，Ve=→∞若α=0.9，溶質(zhì)90%被吸附，動速=（1－α）流速=0.1流速,Ve==10Vtα動速/液速=1－αVe

10.9950.990.90.80.60.50.40.1000.0050.010.10.20.40.50.60.91∞2001001052.521.61.11不同吸附平衡系數(shù)α下溶質(zhì)所需的洗脫體積

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)α的影響因素：⑴pH影響到電性與電量，可使α發(fā)生變化；⑵離子強(qiáng)度增大，可使α下降，減弱溶質(zhì)的吸附；⑶溶質(zhì)的電荷分布，離子交換劑的電荷分布及位阻效應(yīng)對溶質(zhì)的α都有影響；⑷溶質(zhì)的濃度與α則呈反比關(guān)系。離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)根據(jù)上述討論的洗脫機(jī)制，要使蛋白質(zhì)從離子交換劑上解吸而被洗脫，采取的方法有：⑴改變洗脫劑的pH，⑵增加洗脫劑的離子強(qiáng)度，

⑶往洗脫劑中添加特定離子，⑷往洗脫劑中添加一種置換劑，它能置換離子交換劑上所有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)先于置換劑從柱中流出，這種層析方式稱為置換層析。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈡階段洗脫階段洗脫是用一系列洗脫劑進(jìn)行的同溶劑洗脫，在每一階段，僅僅需要約一個柱體積的洗脫劑將此條件下發(fā)生解吸的組分洗脫下來。階段洗脫分為pH階段洗脫和離子強(qiáng)度階段洗脫。pH階段洗脫是用一系列具有不同pH的緩沖液進(jìn)行洗脫，多數(shù)情況下這些緩沖液的緩沖物質(zhì)是相同的，只是弱酸堿和鹽的比例不同。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)離子強(qiáng)度階段洗脫是使用具有相同pH而離子強(qiáng)度不同的同一種緩沖液進(jìn)行洗脫，不同的離子強(qiáng)度通常通過添加不同比例的非緩沖鹽來實(shí)現(xiàn)，最常用的非緩沖鹽是NaCl，也可通過添加乙酸銨等揮發(fā)性鹽的方法來增加離子強(qiáng)度，或直接增加緩沖液中緩沖物質(zhì)的濃度來增加離子強(qiáng)度.

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)階段洗脫技術(shù)簡單易于操作，對于一些層析條件已經(jīng)清楚的蛋白質(zhì)往往有著高的分辨率.但階段洗脫有時效果并不理想.

在初次分離目標(biāo)蛋白時，人們往往先采用連續(xù)梯度洗脫，待確定了樣品的特性和洗脫條件后再考慮采用階段洗脫來優(yōu)化分離效果，縮短操作時間。離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)

離子強(qiáng)度線性梯度洗脫和階段洗脫分離牛血清蛋白圖譜離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)離子強(qiáng)度階段洗脫和線性梯度洗脫效果對比離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)㈢梯度洗脫在進(jìn)行梯度洗脫時，洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度或pH是連續(xù)發(fā)生變化的，在某一條件下，吸附最弱的組分先被洗脫，在進(jìn)一步改變洗脫條件后另一種組分被洗脫。洗脫峰的峰寬一般會小于階段洗脫，拖尾現(xiàn)象也會得到明顯的改善甚至完全消除，并且不會造成同一組分被分離成幾個峰的現(xiàn)象，常常能獲得較高的分辨率。梯度洗脫也分為pH梯度洗脫和離子強(qiáng)度梯度洗脫。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)在層析過程中梯度緩沖液可以通過梯度混合器來獲得。它們都是根據(jù)連通器原理來產(chǎn)生連續(xù)變化的梯度。

鹽濃度梯度曲線可以有不同的形狀，當(dāng)A1＝A2時，產(chǎn)生的是線性梯度；當(dāng)A1＜A2時，產(chǎn)生的是凸形梯度；當(dāng)A1＞A2時，產(chǎn)生的是凹形梯度.離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)梯度的形狀及產(chǎn)生裝置

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)1.在選擇梯度的形狀時，如果是對目的物首次進(jìn)行離子交換分離，強(qiáng)烈建議采用線性梯度.2.凸形梯度有利于改善梯度末尾部分的分辨率，對于一份混合樣品，如果開始階段幾個洗脫峰之間能夠很好的分離，而末尾部分的幾個組分吸附能力比較接近時，采用凸形梯度既有利于末尾部分組分的分離.3.凹形梯度有利于改善梯度起始階段的分辨率，如果混合樣品起始部分組分吸附能力比較接近而末尾部分容易分開，采用凹形梯度能達(dá)到改善分辨率和縮短分離時間的效果。

離子交換層析

第四節(jié)方案設(shè)計(jì)和層析技術(shù)除了梯度的形狀，梯度的高度和斜率也影響著分離的速度和效果。梯度的斜率是指梯度的高度與完成此梯度時所用洗脫劑體積（或時間）的比值。在洗脫過