色譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)

高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)HPLC-MS簡稱LC-MS

HPLC-MS是近些年出現(xiàn)的聯(lián)用儀器，發(fā)展非常迅速，彌補(bǔ)了GC-MS只能測定揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)的不足，使色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到了完善。GC-MS由于接口技術(shù)技術(shù)難度相對較小，因此，開發(fā)使用較早，而HPLC－MS接口技術(shù)技術(shù)難度較大，開發(fā)使用較晚。

HPLC-MS所提供的信息與GC-MS相同（TIC、MC、SIM、全掃描三維圖等）。一、概述

HPLC-MS的特點：

MS作為LC的檢測器不僅能得到色譜數(shù)據(jù)，如：峰保留時間、峰高、峰面積等，同時亦可得到質(zhì)譜信息。具體如下：1、質(zhì)譜為通用性檢測器，可測定不帶生色團(tuán)或熒光基團(tuán)的化合物；2、質(zhì)譜也是選擇性檢測器，用選擇離子檢測可一次完成定性、定量分析，且靈敏度很高。3、提高鑒別化合物的可信度；可準(zhǔn)確分析色譜峰的純度；確定分子量。4、可分析不適合GC-MS分析的親水性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定及生物蛋白化合物。5、在線分析，免去了色譜組分的收集，減少樣品損失，縮短工作周期。6、適用范圍寬，正相、反相、離子對及手性色譜均可使用。7、采用碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)(CID)以及多極質(zhì)譜等可提供豐富的化合物結(jié)構(gòu)信息。由于HPLC目前的應(yīng)用極其廣泛，特別是在我們藥學(xué)專業(yè)應(yīng)用更為普遍，所以LC-MS在使用上比GC-MS有更高的使用價值。與GC-MS基本相同，最大的不同是接口不同。另外，LC-MS一般用來分析揮發(fā)性差，熱不穩(wěn)定的樣品，應(yīng)用范圍增大。非極性化合物不能分析。（難以離子化）VacuumSystemSampleInletDetectorDataSystemMassAnalyserIonisationMethodAtmosphere二、LC-MS的工作原理1.接口的重要性接口是HPLC與質(zhì)量分析器之間的過渡裝置并承擔(dān)著離子化的任務(wù)。由于MS需在真空下操作，以便完成離子形成、分離、檢測的過程。但是HPLC出口含有大量的流動相（溶劑）（0.2～2mL/min）。大量的流動相不得進(jìn)入MS

？HPLC的流動相處在高壓下，液體氣化成氣體，其膨脹系數(shù)約為1000倍以上。1mL流動相液體可氣化成1000mL氣體。流動相的去除是接口的主要任務(wù)之一。不如GC-MS接口成熟，歷史較短。

三、LC-MS的接口2.接口的種類（離子化方法）熱噴霧快原子轟擊（FAB）電噴霧(API-±EI、ESI)√大氣壓化學(xué)源(API-±CI、APCI)√大氣壓光電離源(APPI)粒子束①電噴霧電噴霧接口（ESI）工作原理:三個步驟：a、帶電液滴的形成；b、溶劑蒸發(fā)和液滴碎裂；c、離子蒸發(fā)形成氣態(tài)離子a、帶電液滴的形成色譜流出物經(jīng)毛細(xì)管頂端噴出，形成扇狀噴霧，再3~8kV的高電場作用下，形成高度電離、含有溶劑的試樣微小液滴。b、溶劑蒸發(fā)和液滴碎裂液滴與干燥氣作用，在干燥氣的作用下，溶劑蒸發(fā)，離子向液滴表面移動，造成液滴表面的離子密度越來越大，當(dāng)達(dá)到Rayleigh限時，液滴表面電荷產(chǎn)生的排斥力與液滴表面的張力大致相等，液滴非均勻破裂，分裂成更小的液滴，更小的液滴繼續(xù)重復(fù)蒸發(fā)、電荷過剩和液滴分裂的過程。電噴霧接口（ESI）工作原理:c、離子蒸發(fā)形成氣態(tài)離子當(dāng)液滴分裂至小于10nm時，其表面形成的電場足夠強(qiáng)，電荷的排斥作用導(dǎo)致部分離子從液滴表面蒸發(fā)出來，最終以單電荷或多電荷離子形式從液滴中轉(zhuǎn)移至氣相，形成氣相離子。++++++++++-----++++++++++-----++++++--N2氣流干燥ChargedDroplets電噴霧接口（ESI）液滴變化示意圖:從毛細(xì)管噴出（在3～8kV電場作用下）氣態(tài)試樣離子++++++--氣態(tài)試樣離子試樣＋－+－+Rayleigh限<10nm參見備注以上過程是在大氣壓條件下進(jìn)行的，在強(qiáng)電場驅(qū)使下，電離的溶質(zhì)離子通過一個金屬毛細(xì)管進(jìn)入真空區(qū)，并電場作用不斷加速聚焦進(jìn)入質(zhì)量分析器。ESI的垂直模式：電噴霧接口的特點:主要給出準(zhǔn)分子離子信息，（例如[M+H]＋、[M+Na]＋、[M?H]?、[M?Na]?等），以及大量的多電荷離子，而較少給出化合物的碎片離子；常用于強(qiáng)極性化合物及高分子化合物的測定，一般不適于非極性或弱極性化合物的分析；由于溫度較低，因此較適用于熱不穩(wěn)定化合物；只能允許非常小的液體流量（0.2~1mL）。②大氣壓化學(xué)源(API-±CI、APCI)大氣壓化學(xué)源工作原理

與ESI相似，所不同的是通過電暈放電針首先使溶劑離子化，離子化的溶劑與待分析物氣態(tài)分子發(fā)生離子交換反應(yīng)，形成準(zhǔn)分子離子，使分析物離子化。150℃[Sol+H]+＋M→[M＋H]+＋Sol（質(zhì)子轉(zhuǎn)移）或[Sol+H]－＋M→[M＋H]－＋SolSol+＋M→M+＋Sol或Sol－＋MH→M－＋SH（質(zhì)子抽出）

▲很少產(chǎn)生碎片，離子流集中在幾種離子形式（一般為準(zhǔn)分子離子），所以靈敏度高。

▲信息量少。

▲適用于有一定揮發(fā)性的中等極性或弱極性的樣品，分子量2000以下。

▲允許使用流速高及含水量高的流動相；極易與RP－HPLC匹配。特點：1.接口的選擇四、

LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化ESI和APCI是兩個最常用的接口，他們各自有優(yōu)缺點但相互補(bǔ)充。ESI的優(yōu)勢：適用于中等到強(qiáng)極性物質(zhì)的測定；而弱極性或非極性物質(zhì)無法測定；APCI的優(yōu)勢：適用于弱極性物質(zhì)的測定。也可分析非極性化合物，但靈敏度較低。（1）正離子模式由在溶液中能夠形成的離子極性決定離子的極化方式。如果在溶液中能夠形成的離子為正離子，如堿性物質(zhì)，則離子化模式選擇為正離子模式。得到的準(zhǔn)分子離子一般為[M+H]＋，其他也較常見的如[M+Na]＋、[M+NH4]＋、[M+Na+CH3OH]＋、[M+H+CH3OH]＋等。2.正負(fù)離子模式的選擇

正離子模式一般用乙酸（pH3~4）或甲酸（pH2~3）對樣品進(jìn)行酸化，若樣品的pK值已知，pH至少低于pK值2個單位。（2）負(fù)離子方式如果在溶液中能夠形成的離子為負(fù)離子，如酸性物質(zhì)，則離子化方式選擇為負(fù)離子方式。得到的準(zhǔn)分子離子一般為[M－H]－。負(fù)離子模式可以用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化，pH至少高于樣品pK值2個單位。對于酸堿性不明確的物質(zhì)，可以先使用APCI（+）模式進(jìn)行預(yù)試。（1）種類：甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及易揮發(fā)鹽的緩沖溶液。3.流動相的種類及流量的選擇

若流動相需用緩沖溶液，該緩沖液最好具有揮發(fā)性，這樣可減少緩沖鹽在離子源內(nèi)的沉積。

應(yīng)當(dāng)根據(jù)樣品所需的極性以及樣品的pH值，調(diào)節(jié)流動相的pH。蛋白酵素

流動相應(yīng)當(dāng)具有低的蒸發(fā)熱和低的表面張力，以增強(qiáng)離子的解吸作用，離子化效率提高。（2）流速：和色譜柱的內(nèi)徑有關(guān)，內(nèi)徑越小流量越小。內(nèi)徑(mm)0.31.02.14.6流速(μl/min)1030~60200~500>700MSD與DAD的比較椰子油（椰子油）（三甘油）五、HPLC-MS的靈敏度氨基甲酸鹽六、LC-MS聯(lián)用儀的真空電噴霧是一種“軟”電離技術(shù)，通常只形成準(zhǔn)分子離子，提供分子量信息。但是在實際工作中，特別是對未知化合物的分析，不僅需要分子量，而且更需要盡可能多的化合物碎片信息。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）可解決這一不足。

這里所講的CID是指“源內(nèi)CID，In-SourceCID”。七、

碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)參見備注惰性氣體沒有商業(yè)譜庫縮氨酸（TandemMassSpectrometry）由兩個以上的質(zhì)量分析器串聯(lián)而成。簡稱串聯(lián)質(zhì)譜。常見的為：三級四極桿質(zhì)譜1.空間上的串聯(lián)質(zhì)譜（tandem-in-space）八、多極質(zhì)譜（串聯(lián)質(zhì)譜）API4000三重四級桿質(zhì)譜儀示意圖CID單四極桿與串連四極桿質(zhì)譜對比串聯(lián)質(zhì)譜基本功能：（各種掃描方式）（1）Q1全掃描（2）母離子（precursorion）掃描初始離子掃描（3）子離子（ProductIon）掃描（4）中性碎片丟失掃描（5）多重反應(yīng)監(jiān)測（MultipleReactionMonitoringMRM）各種掃描方式的原理解釋：Q1FullScan(Start–Stop)(Q1全掃描)Q1alwaysusedassingleMSanalyzerUsedprimarilyforident.ofprecursorionSIM-SelectedIonMonitoring

(選擇離子監(jiān)測)UsedtooptimizeanalyzerforspecificionsSIMusedforquantitativeanalysesQ1SIMusedto“optimize”precursorionMaximizesignalinpreparationforMS/MS選擇離子監(jiān)測：SIM用于檢測已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用于定量。若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測，那么可以同時測定幾種離子.PrecursorIonScan(母離子掃描)Q1sweepsagivenmassrange,Q3isfixedUsedtodeterminethe“origin”ofparticularproduction(s)createdinthecollisioncellFrequentlyusedfordrugmetaboliteidentification(commonproductionobservedinthemetabolites)m3+fixedm1+scannedExampleofPrecursorIonSpectrum600900120015001800m/z,amu587.5745.6895.6802.4633.4520.31105.01704.4600900120015001800m/z,amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity,cps608.3520.3802.4600900120015001800m/z,amu3.0e46.0e49.0e4Intensity,cpsPrecursorsionof86Q1Scan745.6母離子掃描的作用母離子分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過程中會生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。ProductIonScan(子離子掃描)Afteridentification,theprecursorionissentintothecollisioncellandfragmentedbyCIDQ1isfixed,Q3sweepsagivenmassrangeUsedforstructuralelucidation（結(jié)構(gòu)確認(rèn)）Firststeptodevelopingquantitativemethodm3+scannedm1+fixedExampleofProductIonSpectrumEphedrine（麻黃堿）,MW=165M+1中性丟失掃描中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，也可以幫助進(jìn)行未知物結(jié)構(gòu)判斷。例如：18-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。MultipleReactionMonitoring(MRM)多重反應(yīng)監(jiān)測PrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CID)Manyprecursortoproductionpairscanbemonitored(A-B,A’-B’,etc.)MRMisthebestwaytomaximizesignalintensityofproductionsMRMusedprimarilyforquantitationMRMforQuantitation?RetentionTimeIntensityRetenti