綠色熒光蛋白的表達(dá)及粗提取

主講人：綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆、表達(dá)及粗提取目錄

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儀器與試劑研究思路研究方法預(yù)期結(jié)果參考文獻(xiàn)研究背景

綠色熒光蛋白簡介

1.一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白2.

GFP是由238個(gè)氨基酸所組成的單體蛋白,相對分子質(zhì)量為27.0kMr3.1962年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)這種綠色的熒光蛋白。1974年，他們分離得到了這個(gè)蛋白目錄

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綠色熒光蛋白優(yōu)點(diǎn)

①熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高；②分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對受體無毒害，安全可靠；③不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，尤其適用于體內(nèi)的即時(shí)檢測；④不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；⑤通過替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。近年來廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域

1.儀器：恒溫培養(yǎng)箱，超凈臺(tái)，恒溫?fù)u床，制冰機(jī)，臺(tái)式離心機(jī)，核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍(lán)盾可見光透射儀，移液器、電泳槽、振蕩器、制冰機(jī)、凝膠成像儀，水浴鍋，高壓滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱，手持式紫外燈2.試劑：BamHI；NotI(10U/μL)；T4ligase；LB培養(yǎng)基；溶液Ⅰ；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；TE緩沖液；20×TBE；GeneFinder-溴酚藍(lán)上樣緩沖液；1×TBE緩沖液目錄

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研究思路目錄

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儀器與試劑研究思路研究方法預(yù)期結(jié)果參考文獻(xiàn)研究背景

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1.質(zhì)粒DNA的分離與純化01質(zhì)粒DNA的分離與純化02酶切及連接03大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化04GFP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).05綠色熒光蛋白的粗提取步驟一步驟二步驟三步驟四步驟五

主要步驟1.1細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增1.2堿提取法1.3質(zhì)粒DNA的提純目錄

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1.質(zhì)粒DNA的分離與純化

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2.酶切及連接雙酶切1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的鑒定2回收酶切產(chǎn)物3連接4目錄

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2.1雙酶切目錄

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儀器與試劑研究思路研究方法預(yù)期結(jié)果參考文獻(xiàn)研究背景反應(yīng)物（μL）pEGFP-N3pET-28a質(zhì)粒1818BamHI22NotI2210×bufferK330.1%BSA緩沖液33

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2.4連接目錄

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研究現(xiàn)狀研究思路研究方法預(yù)期結(jié)果參考文獻(xiàn)研究背景反應(yīng)物體積/μL回收純化的pET-28a質(zhì)粒5gfp基因片段12T4連接酶1緩沖液（10×）2DNA連接酶能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5’-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）3.1感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)3.2轉(zhuǎn)化涂板目錄

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3.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

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4.GFP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1.IPTG（異丙基硫代β-L半乳糖苷）是一種常見的誘導(dǎo)基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，結(jié)構(gòu)類似乳糖。2.GFP基因連接到pET-28a的多克隆位點(diǎn)（MCS），GFP基因的表達(dá)受其上游T7啟動(dòng)子和操縱基因O位點(diǎn)以及結(jié)合到這些順式作用元件的蛋白因子的控制。紫外燈下的綠色熒光蛋白

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4.GFP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)3.LacI基因編碼調(diào)節(jié)蛋白，可以四聚體的形式結(jié)合到操縱基因O位點(diǎn)上，關(guān)閉GFP基因的表達(dá)4.IPTG可與四聚體調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，從而改變調(diào)節(jié)蛋白的構(gòu)象，使調(diào)節(jié)蛋白不再與O位點(diǎn)結(jié)合。接著BL21編碼的T7RNA聚合酶結(jié)合到T7啟動(dòng)子位點(diǎn)，從而啟動(dòng)GFP基因的表達(dá)紫外燈下各組綠色熒光蛋白

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5.粗提取1.挑取鑒定正確的單菌落接入LB培養(yǎng)基2.擴(kuò)大培養(yǎng)3.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4.將菌液進(jìn)行離心，收集菌體5.洗滌菌體，超聲破碎，離心，取上清。訪談結(jié)果與析

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預(yù)期結(jié)果

提取質(zhì)粒加入溶液Ⅰ渾濁；加入溶液Ⅱ變澄清加入溶液Ⅲ出現(xiàn)白色絮狀沉淀加入氯仿抽提溶液分層訪談結(jié)果與析

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儀器與試劑研究思路研究方法預(yù)期結(jié)果參考文獻(xiàn)研究背景

預(yù)期結(jié)果酶切產(chǎn)物鑒定——GFP基因訪談結(jié)果與析

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預(yù)期結(jié)果

重組質(zhì)粒的鑒定訪談結(jié)果與析

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儀器與試劑研究思路研究方法預(yù)期結(jié)果參考文獻(xiàn)研究背景

預(yù)期結(jié)果

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化涂板陰性對照陽性對照訪談結(jié)果與析

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儀器與試劑研究思路研究方法預(yù)期結(jié)果參考文獻(xiàn)研究背景

預(yù)期結(jié)果綠色熒光蛋白菌落參考文獻(xiàn)：[1]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J].JCellComoPhysiok,1962,59:223-239.[2]KainSR,AdamsM,KondepudiA,etal.Greenfluorescentproteinasareporterofgeneexpressionandproteinlocalization.biotechniques,1995,19(4):650[3]PhillipsGJ.Greenfluorescentprotein-abrightideaforthestudyofbacterialproteinlocalization.FEMSmicrobialLett,2001,204(1):9[4]ChalfieM,Tu,EKivchenG,etal.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression.Science,1994,263(5148):802[5]ChalfieM.Greenfluorescentprotein.PhotochemPhotobiol,1995,62(4):651[6]LarrickJW,BalintRF,YouvanDC.Greenfluorescentprotein:untappedpotentialinimmunotechnology.Immunotechnology,1995,1(2):83參考文獻(xiàn)：[7]薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁，黎孟楓，譯.2版.北京：科學(xué)出版，1995.[8]杜禎,馬海利,陳瑞芳.工程菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒pGEM的轉(zhuǎn)化研究中國畜牧獸醫(yī),2007年第34卷第5期[9]NucP.NucK.RecombinantproteinproductioninEscherichiacoli[J].PostepyBiochem,2006,52(4):448-456.[10]DongX,TangB,LiJ,etal.ExpressionandPurificationofIntactandFunctionalSoybean(Glycinemax)SeedFerr