陳娜娜 開題報(bào)告

浙江大學(xué)·動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物在產(chǎn)蛋雞上的耐受性研究ResearchoftheEnduranceofZinc-MethioneininLayingHens陳娜娜214170712015-4-28主要內(nèi)容

研究?jī)?nèi)容2試驗(yàn)方案3

立題依據(jù)1試驗(yàn)創(chuàng)新4進(jìn)度安排5立題依據(jù)1蛋氨酸鋅概念及營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性2蛋氨酸鋅在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用2蛋氨酸鋅應(yīng)用中存在的問題立題依據(jù)蛋氨酸鋅由蛋氨酸與無機(jī)鋅以1：1或2：1的摩爾比例在特定條件下生成的具有獨(dú)特環(huán)狀結(jié)構(gòu)的金屬絡(luò)（螯）合物，是一種類似動(dòng)物體內(nèi)吸收和發(fā)揮生物功能形式的有機(jī)微量元素添加劑。蛋氨酸鋅是農(nóng)業(yè)部“1224號(hào)公告”中允許使用的有機(jī)微量元素添加劑，在畜禽生產(chǎn)上使用廣泛。Zn(C5H10NO2S)2（C5H10NO2SZn）HSO4立題依據(jù)1、蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性與無機(jī)鋅相比，蛋氨酸鋅具有生物學(xué)效價(jià)高、雙重營(yíng)養(yǎng)功能、毒副作用小等營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)。（1）生化性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)飼糧成分破壞小在蛋氨酸鋅中，鋅離子以共價(jià)鍵和離子鍵兩種鍵合形式與蛋氨酸配位體結(jié)合形成特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)?！@種特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以抵抗或緩解鋅與其它礦物質(zhì)元素（例如鈣、銅、錳）的拮抗作用；——同時(shí)避免或減少植酸、纖維與鋅離子在腸道內(nèi)螯合，從而可以提高鋅的吸收率；——同時(shí)還能減輕金屬離子氧化還原反應(yīng)對(duì)飼糧維生素的破壞，從而減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。一、項(xiàng)目任務(wù)來由（背景）（2）蛋氨酸鋅的生化特性接近鋅在動(dòng)物體內(nèi)的吸收利用方式，生物學(xué)效價(jià)高蛋氨酸鋅的生化特性接近鋅在動(dòng)物體內(nèi)的吸收利用方式，能有效促進(jìn)鋅離子運(yùn)輸?shù)教囟ò薪M織和酶系統(tǒng)并發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功能，具有良好的組織定向，減少許多生化過程，節(jié)約體能消耗，生物學(xué)效價(jià)高，能滿足禽類在生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、應(yīng)激等特殊時(shí)期的需求，并減少鋅的排放。（3）蛋氨酸鋅的雙重營(yíng)養(yǎng)功能此外，蛋氨酸鋅既可以滿足機(jī)體所需微量元素——鋅，又可以補(bǔ)充禽類玉米豆粕型飼糧中第一限制性氨基酸——蛋氨酸，具有雙重營(yíng)養(yǎng)功能，其作用效果優(yōu)于無機(jī)鋅。立題依據(jù)（4）蛋氨酸鋅作為“獨(dú)立單元”發(fā)揮特殊的營(yíng)養(yǎng)功能蛋氨酸不僅能夠提高鋅的生物學(xué)利用率，還能作為“獨(dú)立單元”發(fā)揮特殊的營(yíng)養(yǎng)功能，如增強(qiáng)抗菌能力、抗應(yīng)激、改善畜禽繁殖性能等，從而最大程度提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，可起到部分代替抗生素的作用。立題依據(jù)2蛋氨酸鋅在蛋雞生產(chǎn)中的研究進(jìn)展（1）國(guó)外關(guān)于蛋氨酸鋅在蛋雞生產(chǎn)中的研究進(jìn)展Jackson等對(duì)63~88周齡的商品蛋雞進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加蛋氨酸鋅可顯著降低蛋雞的死亡率（8.9%）,并且產(chǎn)蛋率提高8.57%%，其產(chǎn)蛋性能明顯提高。Kienholz等報(bào)道，蛋氨酸鋅能緩解產(chǎn)蛋雞的應(yīng)激，增強(qiáng)其對(duì)室內(nèi)高溫、低鈣日糧的適應(yīng)能力。還有研究表明，蛋氨酸鋅能顯著提高7周齡T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)（18.06%)、抗體IgG含量（12.02%),降低死亡率（7.65%）及球蟲病發(fā)病率（1.66%）。立題依據(jù)2蛋氨酸鋅在蛋雞生產(chǎn)中的研究進(jìn)展（2）國(guó)內(nèi)關(guān)于蛋氨酸鋅在蛋雞生產(chǎn)中的研究進(jìn)展目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蛋氨酸鋅在蛋雞日糧中的添加量報(bào)道不一。許甲平等報(bào)道海蘭褐蛋雞飼糧中添加40mg/kg蛋氨酸鋅生產(chǎn)性能最佳，可使產(chǎn)蛋率提高4.37%；張亞男等研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋后期海蘭灰蛋雞飼糧中使用硫酸鋅且添加水平為70mg/kg時(shí)生產(chǎn)效果效果最佳，140mg/kg蛋氨酸鋅組蛋殼質(zhì)量最好。但也有報(bào)道稱，高劑量的蛋氨酸鋅不僅會(huì)導(dǎo)致資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，而且會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)受阻，生產(chǎn)性能下降，免疫力低下、抗氧化能力降低。Mabe等報(bào)道，飼糧中添加100mg/kg蛋氨酸鋅會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降。立題依據(jù)3蛋氨酸在蛋雞應(yīng)用中存在的問題：2013年7月，歐盟（EU)發(fā)布No.636/2013號(hào)法規(guī)，批準(zhǔn)蛋氨酸鋅作為飼料添加劑使用，并規(guī)定在家禽中的最大添加量為200mg/kg。在我國(guó)，蛋氨酸鋅雖為農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑安全使用規(guī)范》（1224號(hào)公告）中規(guī)定允許使用的飼料添加劑，并且在蛋雞生產(chǎn)中取得了較好的效果，但在實(shí)際應(yīng)用中尚存在以下問題；無行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、蛋雞日糧使用的安全性、有效劑量、使用條件、有效的飼用方式（飲水或飼料)等均有待研究確定，在《飼料添加劑安全使用規(guī)范》（1224號(hào)公告）中未給出安全限量，所以對(duì)蛋氨酸鋅在蛋雞上的應(yīng)用進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)是很有意義的。立題依據(jù)根據(jù)《飼料和飼料添加劑畜禽靶動(dòng)物耐受性評(píng)價(jià)指南（試行）》（農(nóng)辦牧【2011】21號(hào)）以及蛋氨酸鋅對(duì)家禽營(yíng)養(yǎng)的特殊性，設(shè)計(jì)了蛋氨酸鋅在蛋雞上的耐受性試驗(yàn)。主要內(nèi)容

研究?jī)?nèi)容2試驗(yàn)方案3

立題依據(jù)1試驗(yàn)創(chuàng)新4進(jìn)度安排5研究?jī)?nèi)容對(duì)蛋雞進(jìn)行6個(gè)不同劑量的蛋氨酸鋅添加處理，探究不同劑量的蛋氨酸鋅處理對(duì)蛋雞臨床表現(xiàn)、蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血液學(xué)指標(biāo)的影響及對(duì)蛋雞器官組織的毒性作用；通過分析，確定蛋氨酸鋅在蛋雞玉米-豆粕型日糧中的安全限量值，為蛋氨酸鋅在蛋雞生產(chǎn)中應(yīng)用提供指導(dǎo)。主要內(nèi)容

研究?jī)?nèi)容2

試驗(yàn)方案3

立題依據(jù)1試驗(yàn)創(chuàng)新4進(jìn)度安排5試驗(yàn)方案1材料和方法2試驗(yàn)設(shè)計(jì)3飼養(yǎng)管理及試驗(yàn)記錄4指標(biāo)及測(cè)定方法5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)方案飼養(yǎng)試驗(yàn)試驗(yàn)記錄、采樣及指標(biāo)測(cè)定臨床觀察生產(chǎn)性能雞蛋品質(zhì)血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定組織學(xué)檢查技術(shù)路線統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)方案表2蛋氨酸鋅對(duì)蛋雞耐受性試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)處理蛋氨酸鋅添加量（以鋅計(jì)）試驗(yàn)組Ⅰ基礎(chǔ)日糧+0mg/kgZn-Met試驗(yàn)組Ⅱ基礎(chǔ)日糧+70mg/kgZn-Met試驗(yàn)組Ⅲ基礎(chǔ)日糧+140mg/kgZn-Met試驗(yàn)組Ⅳ基礎(chǔ)日糧+350mg/kgZn-Met試驗(yàn)組Ⅴ基礎(chǔ)日糧+700mg/kgZn-Met試驗(yàn)組Ⅵ基礎(chǔ)日糧+1400mg/kgZn-Met注:添加蛋氨酸鋅后調(diào)整每組蛋氨酸水平使其保持一致試驗(yàn)方案1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物產(chǎn)品市場(chǎng)采購(gòu)蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物產(chǎn)品，預(yù)混合，隨同其他飼料原料一起混合。1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物及安置將采食正常、體重相近的健康開產(chǎn)海蘭白蛋雞540只（19周齡，整齊度90%以上），隨機(jī)分為6個(gè)處理，檢驗(yàn)各處理間雞的體重、產(chǎn)蛋率、平均蛋重等差異不顯著，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞，每3只雞一個(gè)單籠（45cm×30cm×30cm）。本試驗(yàn)分為預(yù)試期、正試期兩個(gè)階段。預(yù)試期1周，正試期8周。預(yù)試期飼喂正常的蛋雞全價(jià)料，在一個(gè)周內(nèi)逐漸換為參試日糧。試驗(yàn)方案1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.1試驗(yàn)處理與安排本試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。根據(jù)有效性試驗(yàn)得出的有效劑量，設(shè)計(jì)：0、有效劑量組、2倍有效劑量組、5倍有效劑量組、10倍有效劑量組、20倍有效劑量組，即0、70mg/kg、140mg/kg、350mg/kg、700mg/kg、1400mg/kg。全期需要制作6種全價(jià)配合飼料約4t,共需要蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物10.5kg。消耗飼糧：540×56×120g/h/d=3628.8kg盡量使每個(gè)重復(fù)分開，6個(gè)處理的各重復(fù)均勻分布于雞舍內(nèi)。試驗(yàn)方案

試驗(yàn)蛋雞消耗飼糧預(yù)測(cè)表處理1處理2處理3處理4處理5處理6小計(jì)消耗飼糧/kg604.8604.8604.8604.8604.8604.83628.8消耗蛋氨酸鋅/kg00.2490352940.4980705881.2451764712.4903529414.9807058829.463341176消耗鋅/kg00.0423360.0846720.211680.423360.846721.608768注:蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物中含鋅量為17%試驗(yàn)方案1.2.2試驗(yàn)日糧試驗(yàn)日糧將在參照NRC（1994）和NY/T33-2004的基礎(chǔ)上，并結(jié)合海蘭白產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)手冊(cè)配制，試驗(yàn)擬采用玉米-豆粕日糧，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分含量見下表。試驗(yàn)方案試驗(yàn)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分？試驗(yàn)方案注：1)預(yù)混料為每千克日糧提供：VA12500IU；VD34125IU；VE15IU；VK2mg；硫胺素1mg；核黃素8.5mg；泛酸鈣50mg；煙酸32.5mg；吡哆醇8mg；葉酸5mg；VB125mg；膽堿500mg；Mn65mg；I1mg；Fe60mg；Cu8mg；Se0.3mg。2)添加蛋氨酸鋅后調(diào)整蛋氨酸水平，使其水平保持一致。3)營(yíng)養(yǎng)水平中除鋅為實(shí)測(cè)值，其他均為計(jì)算值。試驗(yàn)方案1.3飼養(yǎng)管理及試驗(yàn)記錄——飼養(yǎng)方式：采用半開放式雞舍3層立體籠養(yǎng)，每排相連的5個(gè)雞籠作為一個(gè)重復(fù)，每籠3只雞（共用180個(gè)雞籠），各重復(fù)平均分布在上中下三排階梯式籠養(yǎng)架上?！庹罩贫龋翰捎米匀还庹蘸腿斯ぱa(bǔ)光方式，光照時(shí)間為16小時(shí)，并保持恒定，采用早晚補(bǔ)光保證光照時(shí)間，光照強(qiáng)度為20lx。試驗(yàn)方案——溫濕度：每天14:00記錄溫度和濕度、天氣情況；隨氣候、季節(jié)和陽光而變化，試驗(yàn)期間溫度變化范圍為20.0±5℃；相對(duì)濕度在40%~70%。——通風(fēng)方式：自然通風(fēng)和橫向負(fù)壓通風(fēng)相結(jié)合；——其他：飼料為干粉料，自由采食，每天加料2次，勻料4次；乳頭式飲水器，自由飲水；專人管理，每日撿蛋兩次；每周帶雞消毒和清理雞糞一次；依本地區(qū)商品代蛋雞常規(guī)防疫制度進(jìn)行免疫。試驗(yàn)方案1.4指標(biāo)及測(cè)定方法1.4.1臨床觀察試驗(yàn)期內(nèi)每天觀察試驗(yàn)動(dòng)物臨床表現(xiàn)、采食和飲水情況、生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)打蔫雞只，及時(shí)淘汰；詳細(xì)觀察和記錄蛋雞的不良反應(yīng)。對(duì)試驗(yàn)中出現(xiàn)的不明原因的死亡進(jìn)行尸檢，進(jìn)行組織學(xué)分析，確定病因。1.4.2生產(chǎn)性能以重復(fù)為單位，記錄每天產(chǎn)蛋數(shù)（包括軟殼蛋、破殼蛋）、日產(chǎn)蛋總質(zhì)量、死亡雞數(shù)，每周記錄雞的耗料量一次。最后計(jì)算出每周和全期的產(chǎn)蛋率、日采食量、平均蛋重、料蛋比、軟殼蛋率等生產(chǎn)性能指標(biāo)。試驗(yàn)方案日期室溫病死只數(shù)淘汰只數(shù)實(shí)存只數(shù)采食量/kg產(chǎn)蛋量蛋重/kg不合格蛋（破、軟）備注重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)4重復(fù)5重復(fù)6產(chǎn)蛋期日常管理記錄表試驗(yàn)方案1.4.3雞蛋品質(zhì)以重復(fù)為單位，每重復(fù)、每周采樣5枚，每周共采180枚雞蛋，當(dāng)日測(cè)定雞蛋品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。采用蛋品質(zhì)測(cè)定儀（以色列OPK公司生產(chǎn)）測(cè)定蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋白高度、蛋黃顏色、雞蛋分級(jí)、哈氏單位和蛋重等指標(biāo)。雞蛋采樣試驗(yàn)方案雞蛋品質(zhì)測(cè)定采樣記錄表周次12345678小計(jì)重復(fù)6×66×66×66×66×66×66×66×6288雞蛋數(shù)量1801801801801801801801801440試驗(yàn)方案每個(gè)重復(fù)雞蛋品質(zhì)測(cè)定記錄表編號(hào)測(cè)定項(xiàng)目蛋重wt(g)蛋殼厚度thk(mm)蛋殼強(qiáng)度str(kgf)蛋白高度height（mm)蛋黃顏色YCF哈氏單位HU雞蛋分級(jí)RK12345試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.4.4血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)分別于2、4、6、8周末，以重復(fù)為單位隨機(jī)選擇1只產(chǎn)蛋雞，分別用一支抗凝管、一支促凝管采血2ml、5ml。一份全血立即測(cè)定血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC)、血紅蛋白（HGB)、紅細(xì)胞壓積（HCT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT)。另一份血樣于3000r/min離心10min制備血漿，上清液分裝于1.5mlEP管中，置于-20℃冰箱保持備用。試驗(yàn)方案血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)周次2468小計(jì)重復(fù)6×66×66×66×6144血清36363636144全血36363636144試驗(yàn)方案測(cè)定指標(biāo)如下：（1）基本生化指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、肌酐、尿酸、血糖、總膽紅素、尿酸氮、堿性磷酸酶等指標(biāo)。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測(cè)定。（2）抗氧化指標(biāo)谷胱甘肽過氧化物酶、銅鋅超氧化物歧化酶、丙二醛含量和總抗氧化能力的測(cè)定。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，測(cè)定時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。（3）免疫學(xué)指標(biāo)IgA、IgG、IgM、溶菌酶水平。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，測(cè)定時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。試驗(yàn)方案基本生化指標(biāo)測(cè)定項(xiàng)目測(cè)定方法測(cè)定意義1AKP微量酶標(biāo)法評(píng)價(jià)含鋅酶活2GOT賴氏法評(píng)價(jià)肝臟功能3GPT賴氏法評(píng)價(jià)肝臟功能4TPRO考馬斯亮藍(lán)法評(píng)價(jià)血清總蛋白指標(biāo)5UA比色法評(píng)價(jià)腎臟功能6CRE除蛋白苦味酸比色法評(píng)價(jià)腎臟功能7GLU葡萄糖氧化酶-過氧化酶法評(píng)價(jià)血糖指標(biāo)8TBILI苯甲酸鈉-咖啡因比色法評(píng)價(jià)肝臟功能9BUN脲酶法評(píng)價(jià)腎臟功能10ALB溴甲酚綠比色法評(píng)價(jià)肝臟功能115‘-NT評(píng)價(jià)含鋅酶活試驗(yàn)方案抗氧化指標(biāo)測(cè)定項(xiàng)目測(cè)定方法測(cè)定意義1GSH-PX比色法評(píng)價(jià)該酶活性2CuZn-SOD抽提法評(píng)價(jià)含鋅酶活3MDATBA法（硫代巴比妥酸法）評(píng)價(jià)氧化狀態(tài)4T-AOC比色法測(cè)定血清總抗氧化能力試驗(yàn)方案免疫學(xué)指標(biāo)測(cè)定項(xiàng)目測(cè)定方法測(cè)定意義1IgA抗原抗體特異性結(jié)合評(píng)價(jià)免疫能力2IgM抗原抗體特異性結(jié)合評(píng)價(jià)免疫能力3IgG抗原抗體特異性結(jié)合評(píng)價(jià)免疫能力4溶菌酶比濁法評(píng)價(jià)免疫能力試驗(yàn)設(shè)計(jì)（4）血漿含鋅量：經(jīng)濃硝酸在MARS5高壓密閉微波消解器（CEM，USA）中濕消化后，在IRISIntrepidⅡ等離子體發(fā)射光譜儀（TE，USA）上測(cè)定Zn的含量。試驗(yàn)方案1.4.5組織學(xué)檢測(cè)（1）內(nèi)臟器官指數(shù)（2）腸粘膜免疫（3）肝臟含鋅酶活（4）組織鋅含量測(cè)定（5）小腸和胰臟MT含量測(cè)定（6）小腸、胰臟MT和ZnT-2mRNA水平（7）組織病理學(xué)檢查試驗(yàn)方案1.4.5組織學(xué)檢測(cè)分別于飼養(yǎng)期的第8、24周，以重復(fù)為單位，每個(gè)重復(fù)選取1只空腹稱重，屠宰，解剖。分別按照如下要求采集、制備、保存樣品。(1)內(nèi)臟器官指數(shù)：剖取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎、胸腺，剔除脂肪組織，并用濾紙吸取血漬，然后迅速稱重。內(nèi)臟器官指數(shù)=內(nèi)臟器官鮮重（g)/活體重（kg）。（2）腸道粘膜免疫：測(cè)定空腸食糜SIgA含量。收集空腸內(nèi)容物，將內(nèi)容物與生理鹽水1:1稀釋，混勻后5000rpm4℃離心15min,分離上清液，測(cè)定SIgA含量。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。試驗(yàn)方案1.4.5組織學(xué)檢測(cè)（3）肝臟含鋅酶活：銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD)、堿性磷酸酶（AKP）、5‘-核苷酸酶（5’-NT)活性測(cè)定。測(cè)定項(xiàng)目測(cè)定方法測(cè)定意義1CuZn-SOD抽提法評(píng)價(jià)含鋅酶活2AKP微量酶標(biāo)法評(píng)價(jià)含鋅酶活35‘-NT評(píng)價(jià)含鋅酶活試驗(yàn)一蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物對(duì)產(chǎn)蛋雞的有效性試驗(yàn)研究主要操作步驟：準(zhǔn)確稱取肝臟0.40g,加入生理鹽水4ml生理鹽水，冰浴勻漿5min后，4℃3000r/min離心15min，取上清液。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。（4）組織鋅含量測(cè)定：摘取肝臟、胰臟、腎臟、左側(cè)脛骨、蛋黃于-20℃保存，以備分析組織鋅含量。測(cè)定方法：經(jīng)濃硝酸在MARS5高壓密閉微波消解器（CEM，USA）中濕消化后，在IRISIntrepidⅡ等離子體發(fā)射光譜儀（TE,USA）上測(cè)定Zn的含量。試驗(yàn)方案（5）小腸、胰臟MT含量：取部分胰臟、小腸于-196℃液氮保存，以備分析MT、ZnT-2mRNA水平。采用鎘血紅蛋白親和力分析法分析小腸、胰臟中MT的含量。主要操作步驟：取大約1g組織樣品（小腸、胰臟），加3倍體積的冰10mMTris-HCl緩沖液（pH7.4），勻漿1~2min，4℃4000rpm離心30min，取上清沸水浴5分鐘，冰浴速冷，4℃10000rpm離心5min，吸取上清液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）小腸、胰臟MT和ZnT-2mRNA水平：采用SYBRGREEN實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法（QRT-PCR)測(cè)定小腸和胰臟中MT和ZnT-2mRNA水平。試驗(yàn)方案主要操作步驟：用Trizol試劑（購(gòu)于Invitrogen公司）一步抽提法提取小腸和胰臟細(xì)胞中的總RNA。用UltraspecⅢ紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其OD260、OD280，計(jì)算OD260/OD280,比值均在1.8以上。用0.8%的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)總RNA的完整性。檢測(cè)后立即對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-80℃冷凍保存待用。采用2–△Ct值法，計(jì)算出MTmRNA、ZnT-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量。按照SuperScriptⅢTMFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR試劑盒（購(gòu)自Invitrogen公司）使用說明，合成cDNA模板。根據(jù)MT、ZnT-2序列和β-actincDNA序列，分別設(shè)計(jì)合成其擴(kuò)增引物，如下表所示。試驗(yàn)方案試驗(yàn)方案（7）組織病理學(xué)檢查試驗(yàn)第8周結(jié)束時(shí)，每重復(fù)選擇1只健康蛋雞，稱重，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。針對(duì)出現(xiàn)中毒癥狀的劑量組及更高劑量組及尸檢異常的動(dòng)物的主要器官（心、肝、脾、肺、腎、胸腺、胰臟、胃、十二指腸、回腸、直腸、淋巴結(jié)、輸卵管、卵巢等組織）進(jìn)行系統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查，并與對(duì)照組合有效劑量組進(jìn)行對(duì)比。檢查方法采用適宜的染色方式，進(jìn)行石蠟切片觀察定性和定量。試驗(yàn)方案1.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS20.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD和Ducan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為極顯著。預(yù)期結(jié)果通過耐受性試驗(yàn)，探究長(zhǎng)期高劑量蛋氨酸鋅對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、免疫指標(biāo)、抗氧化能力、血漿生化指標(biāo)的影響及對(duì)機(jī)體器官組織的毒性作用；通過分析，確定蛋氨酸鋅在蛋雞玉米豆粕型日糧中的安全限量值，即開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)處理組的前一組處理組的蛋氨酸鋅添加量，以期為蛋氨酸鋅在蛋雞生產(chǎn)中應(yīng)用提供指導(dǎo)。主要內(nèi)容

研究?jī)?nèi)容2

試驗(yàn)方案3

立題依據(jù)1

試驗(yàn)創(chuàng)新4進(jìn)度安排5可行性分析浙江大學(xué)飼料所是農(nóng)業(yè)部認(rèn)定的“肉雞和蛋雞飼料有效性評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)”之一，有資格開展新飼料和新飼料添加劑的評(píng)價(jià)試驗(yàn)，飼料所試驗(yàn)基地有能力承擔(dān)新飼料和飼料添加劑評(píng)價(jià)。浙江大學(xué)飼料所擁有儀器設(shè)備總價(jià)值達(dá)5000多萬元，擁有先進(jìn)細(xì)胞分子生物學(xué)儀器能充分保證項(xiàng)目研究的順利進(jìn)行。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案是在國(guó)內(nèi)外研究基礎(chǔ)上，嚴(yán)格參照農(nóng)業(yè)部《飼料和飼料添加劑畜禽靶動(dòng)物有效性評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南（試行）》和《飼料和飼料添加劑畜禽靶動(dòng)物耐受性評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南（試行）》（農(nóng)辦牧[2011]21號(hào)）進(jìn)行設(shè)計(jì)。創(chuàng)新性分析目前，農(nóng)業(yè)部“1224號(hào)公告”中將蛋氨酸鋅絡(luò)（螯）合物列為允許使用的飼料添加劑，但在蛋雞生產(chǎn)中尚