植物遺傳轉化

第十七章：植物遺傳轉化Section1:植物遺傳轉化的方法Section2:轉化植株的檢測Section3:幾種植株遺傳轉化的技術植物遺傳轉化（plangenetictransformation):

應用重組DNA技術、細胞組織培養(yǎng)技術或種質(zhì)系統(tǒng)轉化技術，有目的地將外源基因或DNA片段插入到受體植物基因組中并通過減數(shù)分裂獲得新植株的技術。

第一類：外源裸露基因的直接導入法；通過物理或化學的方法直接將外源目的基因導入植物基因組中?；驑屴D化法第二類：載體介導的轉化方法；通過將目的基因連接在植物表達載體上，隨著載體DNA的轉移而將外源目的基因整合到植物基因組中。農(nóng)桿菌介導轉化法,病毒介導的轉化法第三類：種質(zhì)轉化系統(tǒng)法；包括植物原位真空滲入法和花粉管通道法。Section1:植物遺傳轉化的方法（一）基因槍法基因槍法是指用鎢粉或金粉包裹外源ＤＮＡ，而后依靠基因槍裝置，利用高壓氦氣沖擊波加速微彈去穿透植物細胞壁和細胞膜，使外源ＤＮＡ進入植物細胞并整合到植物細胞染色體組中，從而達到穩(wěn)定遺傳和表達的目的。（1）原理：基因槍法把遺傳物質(zhì)或其他物質(zhì)附著于高速微彈直接射入細胞、組織和細胞器。氣體基因槍可在廣泛的細胞型中得到瞬時的、穩(wěn)定的和高效率的轉化作用。氣體基因槍有一個產(chǎn)生沖擊波的特殊結構，在恰當?shù)臍鈮悍秶鷥?nèi)從3.5MPa-10MPa，具有相應不同的可破裂膜，將包覆DNA的粒子穿越，射入在轟擊室底部的靶細胞中。（2）程序與方法：①轟擊微彈的制備②基因槍轟擊參數(shù)

③受體材料④轟擊樣品①（3）基因槍法優(yōu)缺點基因槍法優(yōu)點：①無宿主限制②受體類型廣泛③質(zhì)粒構造簡單基因槍法缺點：

①儀器設備，轟擊微彈的制備等較為昂貴

②整合的外源基因拷貝數(shù)不易控制

③轟擊對細胞損傷大等（二）農(nóng)桿菌介導法（1）原理：農(nóng)桿菌

是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細后，可將T-DNA插入到植物基因中。農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。

（2）方法：人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T—DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出轉基因植株。農(nóng)桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導轉化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應用。（3）轉化步驟可簡單概括為以下方面：

1、獲取目的基因。用限制酶切割下目的基因。2、基因表達載體的構建。將目的基因與載體（大多數(shù)選用質(zhì)粒）用DNA連接酶連接起來。3、將目的基因導入受體細胞。將含目的基因的重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌（農(nóng)桿菌為受體細胞）。4、目的基因的檢測與鑒定。用DNA分子雜交技術/分子雜交技術/抗原-抗體雜交/個體生物學水平鑒定（這個方法需要導入重組后的細胞的植物體，詳見第五步）幾種方法進行檢驗（根據(jù)要求選取不同方法）。5、最后將成功表達的細胞導入植物體內(nèi)，對植物體進行個體生物學水平鑒定。農(nóng)桿菌介導的過程（4）優(yōu)缺點農(nóng)桿菌介導法優(yōu)點：①轉化頻率較高。

②轉移的外源片段較大。

③整合的外源基因多為單拷貝。④整合到植物基因組的外源基因可以定向表達。

農(nóng)桿菌介導法缺點：①受體植物基因型限制。

②農(nóng)桿菌是一個生物有機體，轉化受植物材料的影響大。（三）其他常用的轉換方法（1）植株原位真空滲入法（2）

聚乙二醇法（3）

脂質(zhì)體介導法（4）電擊法（5）體內(nèi)注射法（6）碳化硅纖維介導法Section2:轉化植株的檢測

以報告基因檢測為例：

報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。目前主要的報告基因如下：Section3:幾種植株遺傳轉化的技術（一）大田作物遺傳轉化的技術①油菜的遺傳轉化技術

農(nóng)桿菌介導轉化法：根據(jù)不同的基因型選擇適的培養(yǎng)基。

外源基因直接導入法：有點擊法、PEG法、顯微注射法、

花粉介導法等。②棉花的遺傳轉化技術

農(nóng)桿菌介導法

花粉管通道法

基因槍法農(nóng)桿菌介導法轉化棉花（二）園藝植物遺傳轉化技術

①黃瓜遺傳轉化

黃瓜遺傳轉化的方法與結果

發(fā)根農(nóng)桿菌介導

根瘤農(nóng)桿菌介導

花粉管通道

floraldip法②花椰菜遺傳轉化

十字花科，具有良好的再生能力。花椰菜遺傳轉化方法如圖：發(fā)根農(nóng)桿菌介導根瘤農(nóng)桿菌