液相色譜法的使用測試課程

高效液相色譜法

HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC一、概述

氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。

通常將液相色譜法按分離機(jī)理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。其實(shí)，有些液相色譜方法并不能簡單地歸于這四類。類型吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備排阻色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分析手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化

主要分離機(jī)理

主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析高壓：載液壓力150~300kg/cm2高速：載液流速1~10ml/min高靈敏：Uv(10-9g)、Fl(10-11g)高效：柱效106、3萬塔板數(shù)/m特點(diǎn)：高壓、高效、高速高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。二、高效液相色譜儀檢測器高壓輸液泵

高壓輸液泵

輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)貯液器高壓泵梯度洗提裝置餾份收集器記錄儀檢測器壓力表HPLC儀流程圖1、輸液系統(tǒng)(1)高壓輸液泵

高壓輸液泵在線脫氣裝置高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。對于帶在線脫氣裝置的色譜儀，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

基本要求：流量準(zhǔn)確可調(diào)。對于一般的分析，流動相的流速在0.5-2mL/min，輸液泵的最大流量一般為5-10mL/min。輸液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。輸液泵必須能精確地調(diào)節(jié)流動相流量，這可以通過電子線路調(diào)節(jié)電機(jī)轉(zhuǎn)速或沖程長短來實(shí)現(xiàn)。流量的測定通常采用熱脈沖流量計(jì)。

主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜分析而言，輸液泵的流量穩(wěn)定性更為重要，因?yàn)榱魉俚淖兓瘯鹑苜|(zhì)的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。輸液泵按工作方式分為氣動泵和機(jī)械泵兩大類。機(jī)械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。幾種高壓輸液泵的性能比較

名稱

恒流或恒壓

脈沖

更換流動相

梯度洗脫

再循環(huán)

價(jià)格

氣動放大泵恒壓無不方便需兩臺泵不可高螺旋傳動注射泵恒流無不方便需兩臺泵不可中等單活塞往復(fù)泵恒流有方便可可較低雙活塞往復(fù)泵恒流小方便可可高隔膜往復(fù)泵恒流有方便可可中等(2)在線脫氣裝置

在線脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。

流動相溶液溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進(jìn)入檢測器后會在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會使流動相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進(jìn)入色譜柱，排出很費(fèi)時間。在熒光檢測中,溶解氧還會使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。

脫氣方法

液相色譜流動相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。

超聲波振蕩脫氣：將配制好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10-20min。這種方法比較簡便。惰性氣體鼓泡吹掃脫氣：將氣源（鋼瓶）中的氣體（氦氣）緩慢而均勻地通入儲液罐中的流動相中，氦氣分子將其它氣體分子置換和頂替出去，而它本身在溶劑中的溶解度又很小，微量氦氣所形成的小氣泡對檢測無影響。真空脫氣裝置：將流動相通過一段由多孔性合成樹脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時，膜外側(cè)被減壓，分子量小的氧氣、氮?dú)?、二氧化碳就會從膜?nèi)進(jìn)入膜外而被脫除。一般的真空脫氣裝置有多條流路，可同時對多個溶液進(jìn)行脫氣。（3）梯度洗脫裝置

通過兩個輸液泵流速的變化，改變流動相的洗脫能力，其作用與氣相色譜的程序升溫類似。ABABCC在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時，經(jīng)常會碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。

在液相色譜中流速（壓力）梯度和溫度梯度效果不大，而且還會帶來一些不利影響，因此，液相色譜中通常所說的梯度洗脫是指流動相梯度，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。線性梯度：在某一段時間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動相強(qiáng)度。階梯梯度：直接從某一低強(qiáng)度的流動相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動相。梯度洗脫裝置是解決溶液的混合問題。主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。高壓梯度：

一般只用于二元梯度，即用兩個高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。高壓梯度系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是，只要通過梯度程序控制器控制每臺泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實(shí)現(xiàn)自動化控制。缺點(diǎn)是使用了兩臺高壓輸液泵，使儀器價(jià)格變得更昂貴，故障率也相對較高，而且只能實(shí)現(xiàn)二元梯度操作。

低壓梯度：只需一個高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。因?yàn)楸壤y是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常配置在線脫氣裝置。如四元梯度系統(tǒng)：來自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后的四種溶液進(jìn)入比例閥，混合后從一根輸出管進(jìn)入泵體。多元梯度泵的流路可以部分空置。

2、進(jìn)樣系統(tǒng)

通常采用六通伐進(jìn)樣：色譜柱色譜柱泵泵12進(jìn)樣進(jìn)樣器是將樣品溶液準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置，分手動和自動兩種方式。

進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，進(jìn)樣時引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動要很小?，F(xiàn)在的液相色譜儀所采用的手動進(jìn)樣器幾乎都是耐高壓、重復(fù)性好和操作方便的六通閥進(jìn)樣器，其原理與氣相色譜中所介紹的相同。3、色譜柱Normalcolumn 5-um、4.6-umNarrowborecolumn 1-3umMicrocolumn <1um

色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。直型，柱長10~100cm。分析柱內(nèi)徑2~5mm,制備柱6~10mm。色譜填料：經(jīng)過制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10μm粒徑的球形顆粒。色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長250mm。色譜填料是由基質(zhì)和功能層兩部分構(gòu)成。

基質(zhì)：

又常稱作載體或擔(dān)體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對分離不起明顯的作用，只是作為功能基團(tuán)的載體。常用來作基質(zhì)的有硅膠和有機(jī)高分子聚合物微球。

功能層：是通過化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對樣品分子的保留起實(shí)質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán)。如硅膠基質(zhì)的冠醚大分子固定相，功能層冠醚分子吸附或鍵合在硅膠基質(zhì)的表面。填料的物理結(jié)構(gòu)：

分為微孔型（或凝膠型）、大孔型（全多孔型）、薄殼型和表面多孔型四種類型。4、檢測器用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。 目前最常用的檢測器主要有：紫外-可見檢測器熒光檢測器電化學(xué)檢測器示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器質(zhì)譜檢測器檢測器檢測下限/(g/ml)

線性范圍

選擇性

梯度淋洗

主要特點(diǎn)

紫外-可見光10-10103-104有可對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很?。粚θ苜|(zhì)的響應(yīng)變化大。

熒光10-12-10-11103有可選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響?；瘜W(xué)發(fā)光

10-13-10-12103有困難靈敏度高；發(fā)光試劑受限制；易受流動相組成和脈動的影響。

電導(dǎo)

10-8103-104有不可是離子性物質(zhì)的通用檢測器；受溫度和流速影響；不能用于有機(jī)溶劑體系。電化學(xué)

10-10104有困難選擇性高；易受流動相pH值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性較差。

HPLC中常見檢測器的基本特性

蒸發(fā)光散射

10-9

無可可檢測所有物質(zhì)。示差折光10-7104無不可可檢測所有物質(zhì)；不適合微量分析；對溫度變化敏感質(zhì)譜10-10無可主要用于定性和半定量。原子吸收光譜10-10-10-13有可選擇性高。等離子體發(fā)射光譜

10-8-10-12有可可進(jìn)行多元素同時檢測?；鹧骐x子化10-13-10-12104有可柱外峰展寬。

應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍寬；流通池可以很?。?mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

（1）紫外-可見檢測器基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。

很多有機(jī)分子都具紫外或可見光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見光吸收能力，因此UV-VIS檢測器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對環(huán)境溫度、流速、流動相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。

用UV-VIS檢測時，為了得到高的靈敏度，常選擇被測物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長作檢測波長，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動相。直接紫外檢測：所使用的流動相為在檢測波長下無紫外吸收的溶劑，檢測器直接測定被測組分的紫外吸收強(qiáng)度。多數(shù)情況下采用直接紫外檢測。

間接紫外檢測：使用具有紫外吸收的溶液作流動相，間接檢測無紫外吸收的組分。在離子色譜中使用較多，如以具有紫外吸收的鄰苯二甲酸氫鉀溶液作陰離子分離的流動相，當(dāng)無紫外吸收的無機(jī)陰離子被洗脫到流動相中時，會使流動相的紫外吸收減小。

柱后衍生化光度檢測：

對于那些可以與顯色劑反應(yīng)生成有色配合物的組分（過渡金屬離子、氨基酸等），可以在組分從色譜柱中洗脫出來之后與合適的顯色劑反應(yīng)，在可見光區(qū)檢測生成的有色配合物。

二極管陣列檢測器（diode-arraydetector,DAD）：以光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測元件的UV-VIS檢測器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時間、光強(qiáng)度和波長的三維譜圖。普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進(jìn)入流動池。二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢測。紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。光電二極管陣列檢測器光源檢測室光柵二極管陣列檢測器（2）熒光檢測器原理：

許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，如有機(jī)胺、維生素、激素、酶等，被一定強(qiáng)度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度、量子效率和樣品濃度成正比。有的有機(jī)化合物雖然本身不產(chǎn)生熒光，但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測。

特點(diǎn)：有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測法高23個數(shù)量級，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；（3）電化學(xué)檢測器（電導(dǎo)檢測器conductivitydetector,CD）電導(dǎo)儀電極電極

原理：基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。電導(dǎo)檢測器是離子色譜中必備的檢測器。

電導(dǎo)檢測器的構(gòu)成：由電導(dǎo)池、測量電導(dǎo)率所需的電子線路、變換靈敏度的裝置和數(shù)字顯示儀等幾部分組成，電導(dǎo)池是其核心。

電導(dǎo)池的結(jié)構(gòu)：

檢測體積可達(dá)到微升甚至納升級。其基本結(jié)構(gòu)是在柱流出液中放置兩根電極，然后通過適當(dāng)?shù)碾娮泳€路測量溶液的電導(dǎo)。圖8-17是一種簡單結(jié)構(gòu)的電導(dǎo)池。

電導(dǎo)檢測器工作原理：

電導(dǎo)池工作時，向電導(dǎo)池的兩個電極施加電壓，溶液中的陰離子向陽極移動，陽離子向陰極移動。在電解質(zhì)溶液中的離子數(shù)目和離子的移動速率決定溶液的電阻大小，離子的遷移率或單位電場中離子的速率取決于離子的電荷及其大小、介質(zhì)類型、溶液溫度和離子濃度。離子的遷移速率取決于施加電壓的大小。所施加的電壓既可以是直流電壓，也可以是正弦波或方波電壓。當(dāng)施加的有效電位確定后，即可測量出電路中的電流值，即能測出電導(dǎo)值。

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；

偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；（4）示差折光檢測器（differentialrefractometers,RI）

原理：基于樣品組分的折射率與流動相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來時，會引起流動相折射率的變化，這種變化與樣品組分的濃度成正比。示差折光檢測法也稱折射指數(shù)檢測法。絕大多數(shù)物質(zhì)的折射率與流動相都有差異，所以RI是一種通用的檢測方法。雖然其靈敏度比其他檢測方法相比要低1-3個數(shù)量級。對于無紫外吸收的有機(jī)物（如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴）是比較適合的。在凝膠色譜中是必備檢測器，在制備色譜中也經(jīng)常使用。（5）蒸發(fā)光散射檢測器（evaporativelight-scatteringdetector,ELSD）

ELSD是基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測器。由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮?dú)猓╈F化成微細(xì)液滴，液滴通過加熱漂移管時，流動相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測器。適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸。

適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾三、高效液相色譜分離模式（一）液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；

流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。（二）液-液分配色譜

liquid-liquidpartitionchromatography

液-液分配色譜固定相的液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現(xiàn)性很差。

后來發(fā)展起來的鍵合固定相以化學(xué)鍵合的方法將功能分子結(jié)合到惰性載體上，固定相不會溶解到流動相中。鍵合固定相OHOHOHOOO+C18H37SiCl3SiC18H37非極性鍵合固定相：

鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS（OctaDecyltrichloroSilane）柱或C18柱就是最典型的代表，其極性很小。極性鍵合固定相：

鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。正相HPLC（normalphaseHPLC）：

是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：

由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式。

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；

陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。（三）離子交換色譜

ion-exchangechromatographyIEC使用表面有離子交換基團(tuán)的離子交換劑作為固定相。帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽離子的分離，帶正電荷的交換基團(tuán)（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離。SO3H+M+

SO3M+H+

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；

反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對Y+X-后；在兩相間分配。（四）離子對色譜

ionpairchromatography抑制柱離子色譜的原理：以陰離子分析為例：分析柱反應(yīng)：R—Cl+NaOH R—OH+NaCl抑制柱反應(yīng)：R—H+NaCl R—Na+HClR—H+NaOH R—Na+H2O（五）排阻色譜size-exclusionchromatography（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）原理：

以多孔性物質(zhì)作固定相，樣品分子受固定相孔徑大小的影響而達(dá)到分離的一種液相色譜分離模式。大分子全排出 VR=V0小分子全進(jìn)入 VR=V0+VS中分子部分進(jìn)入 VR=V0+KVS

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離

1.液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；四、液相色譜固定相

stationaryphasesofLC

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N（3）化學(xué)鍵合固定相傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2.液-固吸附分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）3.離子交換色譜分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。4.空間排阻分離固定相1.流動相特性

液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；

親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。

若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。五、液相色譜的流動相

mobilephasesofLC

按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2.流動相類別

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)3.流動相選擇盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。4.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題1.影響分離的因素與提高柱效的途徑

在高效液相色譜中,液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即：H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。六、影響分離的因素

factorsinfluencedseparation液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫

改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。

流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。

3.固定相及分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。2.流速

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器2.稠環(huán)芳烴的分析七、分離類型選擇

choiceofseparationtypes環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：差示折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。陰離子分析:

雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。離子色譜的應(yīng)用八、制備型液相色譜

preparativeliquidchromatography制備型高效液相色譜系統(tǒng)主要應(yīng)用在植化、合成、制藥、生物及生化等領(lǐng)域的產(chǎn)品的提取及純化工作中。在不同的工作領(lǐng)域中，組份的提取和純化量的差異是很大的。在生物技術(shù)領(lǐng)域中，酶的分離是微克級；在植化和合成化學(xué)領(lǐng)域中，為了鑒別未知成份并進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，需要得到一至若干毫克的純品；在藥品和醫(yī)藥學(xué)測試中，需要克級的標(biāo)準(zhǔn)品和對照品；在當(dāng)今的工業(yè)級提純中，制藥成份往往需要千克級的提取。在分析液相中色譜柱的典型進(jìn)樣量是微克級，甚至更低。樣品量和固定相之比有的甚至小于1:100000。進(jìn)樣體積一般來說都大大小于色譜柱體積（小于1:100）。在這種條件下，會達(dá)到很好的分離效果，峰形尖銳并且很對稱。而在制備液相中，最大的區(qū)別就是超量進(jìn)樣。

獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。半制備柱（內(nèi)徑8mm，長度15～30cm），一次制備量０.1～１mg；1.色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）對分析柱：不影響柱效時的最大進(jìn)樣量；對制備柱：不影響收集物純度時的最大進(jìn)樣量；超載：進(jìn)樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。2.液相制備色譜的方法色譜柱載樣和超量載樣色譜柱超量載樣，暨在相同的分析條件下超量進(jìn)樣

使用色譜柱超量載樣的方法，在分析柱上甚至可以進(jìn)行毫克級的分離。但更大量的樣品分離就需要整個系統(tǒng)的放大。色譜柱超量載樣可以通過兩種方法進(jìn)行：濃縮法和體積超載法在濃縮法中，樣品的濃度會提高，但進(jìn)樣體積保持不變。容量因子k’降低，同時峰形從高斯曲線變?yōu)榫匦?。濃縮法超量載樣只有在樣品組份在流動相中具有良好的溶解性的條件下才有可能采用。如果樣品組份的溶解性很差，濃縮法超量載樣不能使用。使更多的樣品體積注射到色譜柱中，這種技術(shù)稱作體積法超量載樣。超過一定的進(jìn)樣體積，峰高不變，但峰變寬并且呈矩形。兩種超量載樣技術(shù)通常被結(jié)合起來使用。兩種技術(shù)的概覽濃縮法超量載樣

體積法超量載樣取決于組份在流動相中的溶解性取決于進(jìn)樣體積

吸附變化線的制備部分吸附變化線的分析部分生產(chǎn)效率決定于選擇性

生產(chǎn)效率決定于制備柱直徑受固定相粒度大小的影響不大需要小顆粒填料收集組分時，通常有以下情況：

可獲得良好分離，主峰使用制備柱，超載提高效率；兩主成分之間的小組分；超載，分離切分使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備。

制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。制備柱：內(nèi)徑20～50mm，柱長50cm。3.制備型液相色譜1.概述

超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質(zhì)的一種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發(fā)展，具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點(diǎn):（1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。九、超臨界流體色譜

supercriticalfluidchromatography,SFC

性質(zhì)介于液體和氣體之間;具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴(kuò)散系數(shù)位于兩者之間?？赏ㄟ^改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。

超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。2.超臨界流體性質(zhì)超臨界流體：指高于臨界壓力和臨界溫度時的一種物質(zhì)狀態(tài)，它既不是氣體，也不是液體，但它兼具氣體的低粘度和液體的高密度以及介于氣體和液體之間的較高擴(kuò)散系數(shù)等特征。SFC：以超臨界流體作流動相，以固體吸附劑（如硅膠）或鍵合在載體（或毛細(xì)管壁）上的有機(jī)高分子聚合物作固定相的色譜方法。常用流動相：超臨界狀態(tài)下的CO2、氧化亞氮、乙烷、三氟甲烷等。CO2最常用，因?yàn)樗呐R界溫度低（31℃）、臨界壓力適中（7.29MPa）、無毒、便宜，但其缺點(diǎn)是極性太低，對一些極性化合物的溶解能力較差，所以，通常要用另一臺輸液泵往流動相中添加1-5％的甲醇等極性有機(jī)改性劑。

色譜柱：液相色譜的填充柱和氣相色譜的毛細(xì)管柱都可以使用，但由于超臨界流體的強(qiáng)溶解能力，所使用的毛細(xì)管填充柱的固定相必須交聯(lián)。

應(yīng)用：從理論上講，SFC既可以象液相色譜一樣分析高沸點(diǎn)和難揮發(fā)樣品，也可象氣相色譜一樣分析揮發(fā)性成分。不過，超臨界流體色譜更重要的應(yīng)用是用來作分離和制備，即超臨界流體萃取。

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC；

分離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離；通過調(diào)節(jié)流動相的壓力（調(diào)節(jié)流動相的密度），調(diào)整組分保留值；3.原理

SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）；超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點(diǎn)，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對分離的影響?。?/p>

壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時間縮短。

CO2流動相，當(dāng)壓力改變：7.0→9.0×106Pa，則：C16H34的保留時間25min→5min。壓力效應(yīng)：程

序

升

壓HPLC與SFC

比較4.結(jié)構(gòu)流程

（1）SFC的高壓泵

無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計(jì)算機(jī)控制流動相的密度和流量；（2）SFC的色譜柱和固定相

可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱；SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC；5.主要部件（3）流動相

SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3

CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機(jī)物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點(diǎn)：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4）檢測器

可采用液相色譜檢測器，也可采用氣相色譜的FID檢測器1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m×63μmi.d.

毛細(xì)管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動相：CO2；柱溫：120C；程序升壓；超臨