免疫標記技術

免疫標記技術免疫標記技術

免疫標記技術指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應；并藉助于熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結果直接鏡檢觀察或進行自動化測定。

免疫標記技術可以在細胞、亞細胞、超微結構及分子水平上，對抗原抗體反應進行定性和定位研究；或應用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定。因此，免疫標記技術在敏感性、特異性、精確性及應用范圍等方面遠遠超過一般免疫血清學方法。

常用的幾種免疫標記技術免疫熒光標記技術放射免疫標記技術酶標記技術膠體金標記技術生物素和親和素標記技術發(fā)光免疫標記技術免疫熒光標記技術基本原理：

免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體(或抗原)結合、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其存在部位。在實際工作中，由于用熒光素標記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術。熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產生熒光，并能作為染料使用的有機化合物。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。

熒光效率

熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。

熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）

發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的最大吸收峰波長，且測定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也最大。

熒光抗體染色方法：A.直接法：這是熒光抗體技術最簡單和基本的方法。滴加熒光抗體于待檢標本片上，經反應和洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。標本中如有相應抗原存在，即與熒光抗體特異結合，在鏡下可見有熒光的抗原抗體復合物。此法的優(yōu)點是簡單、特異。但其缺點是檢查每種抗原均需制備相應的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法B.間接法：用熒光素標記二抗。檢測過程分為兩步：第一次，將待測一抗加在含有已知抗原的標本片上作用一定時間，洗去未結合的抗體。第二，滴加標記二抗。如果第一步中的抗原抗體已發(fā)生結合，此時加入的標記二抗就和已固定在抗原上的一抗結合，形成抗原-抗體-標記抗抗體復合物，并顯示特異熒光。此法的優(yōu)點是敏感性高于直接法，且無需制備每一種熒光素標記的特異抗體，就可用于檢測同種動物的多種抗原抗體系統(tǒng)。間接法的缺點是有時易產生非特異性熒光。直接免疫熒光法原理示意圖間接免疫熒光法原理示意圖放射免疫標記技術基本原理：

放射免疫標記技術是將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應的特異性相結合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法。

由于放射免疫標記技術具有靈敏度高(可檢測出毫微克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物質，特異性強(可分辨結構類似的抗原)、重復性強、樣品及試劑用量少測定方法易規(guī)范化和自動化等多個優(yōu)點。因此、在醫(yī)學及其他生物學科的研究領域和臨床實驗診斷中廣泛應用于各種微量蛋白質、激素、小分子藥物及腫瘤標志物等的分析與定量測定。缺點是試劑使用期限短，存在放射性污染

。目前常用的同位素是125I

A.放射免疫測定(Radioimmunoassay，RIA)標記抗原和未標記抗原對有限量抗體的競爭性結合或競爭性抑制反應。B.免疫放射測定(IRMA)待測抗原與過量標記抗體的非競爭綜合反應。C.放射受體分析(RRA)與免疫放射測定相似。應用放射性同位素標記配體，在一定條件下與相應受體結合成配體-受體復合物。酶免疫標記技術

免疫酶技術就是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合而建立的一種新技術。酶與抗體或抗原結合后，既不改變抗體成抗原的免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性，即在相應而合適的作用底物參與下，使基質水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計加以測定。這是一種特異而敏感的技術，可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。

酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可導致大量的催化過程，所以極為敏感。它的催化過程有兩種基本形式：

(1)E十S→(ES)→E十P

(2)E十S→＝(ES)

(ES)十D1→E十P十D2

E為酶，S為酶作用的底物，P為底物分解后的產物，D，為供氫體，D：為D1的氧化型。如P或D：為有色化合物，即可用呈色反應顯示酶的存在。

常用的酶及其底物酶底物顯色反應測定波長辣根過氧化物酶(HRP)鄰苯二胺(OPD)四甲替聯(lián)苯胺(TMB)5氨基水楊酸(5AS)鄰聯(lián)苯甲胺(OT)2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)3.3－二氨基聯(lián)苯胺

(DAB)

橙紅色

藍綠色棕色藍綠色藍綠色

棕色不溶性沉淀492450449

425642

堿性磷酸酯酶(AP)4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

黃色405BCIP/NBT黑紫色沉淀萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽紅色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黃色405420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭深藍β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

螢光360450硝基酚半乳糖苷(ONPG)黃色420辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)

比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm

HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分子醇的過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2O

供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。如DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應產物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由于產物不穩(wěn)定，需要在短時間內進行測定。

目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產物為橙紅色，后者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2,2‘-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好，ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。HRP標記抗體的方法

A.戊二醛法

B.過碘酸鹽氧化法

膠體金標記技術

膠體金標記技術(Immunogoldlabelingtechnique)是以膠體金作為示蹤標記物，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。利用它在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質，與蛋白質分子的正電荷基團藉靜電吸引而形成牢固結合，除抗體蛋白外，膠體金還可與其他多種生物大分子結合。根據膠體金的一些物理特性，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物所具有的免疫-生物學特性，使其在免疫學、組織學、病理學及細胞生物學標記研究工作中得到廣泛應用。

膠體金標記技術

生物素與親合素標記技術

生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期應用于免疫學，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應，并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。BAS已經廣泛應用于生物醫(yī)學實驗研究的各個領域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質用于上述各類反應體系中反應物的分離、純化。

親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結合常數(shù)高達1015M-1)。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。

BASBAS用于檢測的基本方法

A.標記親和素連接生物化大分子反應體系，稱BA法B.以親和素兩端分別連接生物素化大分子反應體系和標記生物素，稱為BAB法C.將親和素與酶標生物素共溫形成親和素-生物素-過氧化物酶復合物，再與生物素化的抗抗體接觸時，將抗原-抗體反應體系與ABC標記體系連成一體，稱為ABC法。

發(fā)光免疫標記技術

發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立的一種新型超微量分析技術。這種方法兼具有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反應的高度特異性。

A.化學發(fā)光是指伴隨化學反應過程所產生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質在進行化學反應時，吸收了反應過程中所產生的化學能，使反應產物分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當電子從激發(fā)態(tài)的最低振功能級回到基態(tài)的各個振動能級時產生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。

B.生物發(fā)光是指發(fā)生在生物體內的發(fā)光現(xiàn)象，如熒火蟲的發(fā)光。以往化學發(fā)光和生物發(fā)光看作是彼此獨立的過程，隨著這一領域研究的深人，逐漸加深了對各種生物發(fā)光反應機理的認識。實際上，生物體內的各種發(fā)光現(xiàn)象都與化學反應有關，實際上生物發(fā)光是發(fā)生在生物體內的一種化學發(fā)光。

發(fā)光免疫分析的類型

化學發(fā)光免疫分析:以化學發(fā)光物質標記抗原或抗體，免疫反應后，直接引發(fā)化學發(fā)光反應進行檢測?；瘜W發(fā)光酶免疫分析:用參與某些發(fā)光反應的酶來標記抗原或抗體。免疫反應后，加入發(fā)光試劑，測定發(fā)光體系的發(fā)光強度進行抗原或抗體測定。

生物發(fā)光免疫分析:利用生物發(fā)光物質或參與生物發(fā)光反應的輔助因子標記抗原或抗體。免疫反應后，運用生物發(fā)光反應進行檢測。

免疫印跡化學發(fā)光試劑（ECLReagent）

基本原理:辣根過氧化酶使試劑中的發(fā)光物（Lumino