天門冬氨酸生產工藝小總

天冬氨酸生產工藝的研究進展一、 天冬氨酸簡介天冬氨酸（Asparticacid）又稱氨基丁二酸，是構成機體蛋白質的主要氨基酸之一。結構式為：HOOC-CH2-CH（NH2）-COOH，分子量133.10。它有兩種旋光異構體：D型和L型。通常所說的天冬氨酸是指等量的D型和L型的混合物，為無色單斜棱柱形結品，溶于水，微溶于75%（w/w）乙醇，不溶于乙醚，熔點278°C?280°C；L型為無色菱形片狀結品，溶于水，微溶于醇，熔點269°C?271°C；D型溶于水、鹽酸，不溶于乙醇及乙醚，熔點251C。二、 合成方法2.1化學合成法化學法主要用于生產天冬氨酸的外消旋體DL-天冬氨酸。順丁烯二酸酐和過量氨水與NH￡反應，反應在一間歇反應釜中，于140C、0.4MPa下反應2.5h。將得到的混合物冷卻至70C后用鹽酸酸化至pH2.5,再冷卻全室溫，此時天冬氨酸沉淀析出，將沉淀過濾，4C下水洗后得到產品，產率為55%。成都有機化學研究所的鄧潤華等采用微波法合成的收率為61.4%。該方法采用苯亞甲氨基乙酸乙酯為原料，在相轉移催化劑（TEBA）催化下進行鹵化反應，經水解生成天冬氨酸外消旋體。2002年，浙江大學的邢亞軍等在一鈦材高壓釜中，對順丁烯二酸酐）進行氨化反應合成7DL-天冬氨酸。通過實驗研究對原有合成工藝作出了改進，使產品收率提高到70%以上，并且對產品的分離提純采用順丁烯二酸（馬來酸）代替鹽酸進行酸化結品從而提高了反應物的利用和減少反應剩余物的污染。2003年天津大學的王亞權等提出了一種簡便的、不使用任何催化劑的化學合成法。實驗在聚四氟襯里的250ml高壓釜中進行。實驗步驟如下：將32.5g順丁烯二酸酐（分析純）溶于70ml水中，加入氨水（分析純）至pH8,充1MPa氮氣，然后在電磁攪拌下加熱至453K，反應6出反應后冷卻全室溫，過濾后得無色品體，收率63.1%，熔點338C。產物的紅外光譜與DL-天冬氨酸的標準譜圖吻合，容量分析表明天冬氨酸含量N98%。2.2生物酶法生物酶法IC法（固定化細胞法或固定化酶法）1973年，ChibataI等將大腸桿菌中提純的天冬氨酸酶，包埋在交聯(lián)聚丙烯酰胺中制成固定化酶，富馬酸和氨水由固定化天冬氨酸酶催化合成L-天冬氨酸。1974年，ChibataI等進一步將高天門冬氨酸酶活力的大腸桿菌直接用聚丙烯酰胺包埋，制成固定化細胞。提高了酶的穩(wěn)定性，避免了酶提取的復雜過程，首次實現了由富馬酸轉化為L-天冬氨酸的工業(yè)化生產，轉化率達到99%，開創(chuàng)了細胞固定化應用于工業(yè)生產的先例。1979年，SatoT等對固定化細胞的方法進行了改進，用天然產物k-角叉菜膠代替聚丙烯酰胺包埋大腸桿菌細胞，并用戊二醛、戊二醛及環(huán)己二胺處理固定化細胞，以可溶性天冬氨酸酶為對照，研究了這三種固定化細胞中酶的性質。三種固定化細胞的酶促反應的最適pH為9,而可溶性天冬氨酸酶的最適反應pH為9.5。固定化酶的最適溫度比可溶性天冬氨酸酶高5C?10C。固定化細胞的表觀Km值大約為可溶性天門冬氨酸酶的Km值的5倍。細胞經固定化后，熱穩(wěn)定性得到提高。固定化細胞柱在PH8.5時比在天冬氨酸酶反應最適pH下操作穩(wěn)定性高。1981年?1983年居乃琥等利用大腸桿菌菌株，制備固定化大腸桿菌細胞，用于連續(xù)生產天冬氨酸，小試每g濕細胞的天冬氨酸的產量最高可達1007g（30天）。中試每g濕細胞的天冬氨酸產量為722g（25天）。該法所用的戊二醛的濃度和添加量，比一般方法的低。由于戊二醛用量少，交聯(lián)不充分，所以固定化細胞酶活力的回收率高，成本低，但穩(wěn)定性較差，使用壽命短，所以要適當增加戊二醛的用量。1995年胡永紅，歐陽平凱建立了固定化細胞分離L一蘋果酸生產中殘留富馬酸并將其轉化成L-天門冬氨酸的新方法。對生成L-天門冬氨酸的工藝條件進行優(yōu)化，結果表明，當L-蘋果酸反應液pH調至8~9,L-天門冬氨酸添加量為6-8g/L,碳酸銨加量為15-20g/L,Mg2+、M?、Ca2+等二價陽離子加量為1mmol/L時，固定化細胞可將L一蘋果酸反應液中殘留的20%左右的富馬酸幾乎全部轉化成L-天門冬氨酸，且L一蘋果酸含量的損失小于5%。1996年張波采用三種不同發(fā)酵培養(yǎng)基，經過不同發(fā)酵時間取樣測定酶活（EA）、pH、生物量（Biomass），確定選用培養(yǎng)基A；經不同底物濃度、不同金屬離子對固定化細胞轉化率的影響的實驗，確定使用較高濃度底物及含Mg2+的底物為佳，經實驗測得固定化細胞的使用壽命為3個月，即3個月之內能保持轉化率在85%以上，固定化細胞的轉化時間為3.5h。1997年石屹峰等［21］設計了用于固定游離細胞生物轉化的反沖式膜反應器（圖1），利用膜將游離細胞阻擋于反應器內，同樣達到固定化目的而又不損傷細胞（酶）。菌種采用研究者自己選育的含高活力天冬氨酸酶的EscherichiacoliSF-D4,培養(yǎng)基為1%反丁烯二酸胺，1%玉米漿,0.7%蛋白胨,0.1%KHPO,0.5%（NH）SO,0.02%MgSO。pH7.2,37°C,搖床培養(yǎng)24h。細胞離24 42,?4 4心10,000r/min、10min收集,用生理鹽水洗2次。選擇0.22Lm微濾膜，最佳細胞濃度為35mg/mL。國］攪件反沖式膜反應器Fig.ISchemari-cdiagramofmembraTiereaclorinbirredbackcpeTirrmnI-底凱2-蒞3-調節(jié)間4-過?慮臆反應密f-假沌腮7-愜力攜打展-恒耕槽患-酶門。-產別張今等圍繞天冬氨酸酶的活性部位、末端缺失突變、蛋白質工程菌的固定化等方面進行了研究。將突變菌株用瓊脂凝膠包埋法進行固定，固定菌量為95%,表觀酶活力為82000單位，半衰期184d。實驗表明，1kg固定化細胞，每24h約得L-天冬氨酸30kg，日本三菱石化公司已用黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)發(fā)酵法生產L-天門冬氨酸。以往常用的細菌是大腸桿菌(E.coli),因它的細胞壁脆弱，要循環(huán)使用必須將菌固定化于載體上，而該公司所用黃色短桿菌有堅韌的細胞壁，故無需用昂貴的固定化方法，經離心分離反復可供反應使用。所以，用這種制造方法生產成本下降。FWC法(游離細胞法或游離酶法)1996年，南京化工大學徐虹等使用發(fā)酵培養(yǎng)基：富馬酸2%，，玉米漿4%,KHPO;0.2%,MgSO,0.025%,用氨水調節(jié)pH至7.2~7.5。培養(yǎng)溫度為37C，培養(yǎng)時間為426h左右。以大腸桿菌培養(yǎng)液作酶源，采用游離酶法由富馬酸轉氨生成天冬氨酸。取培養(yǎng)26h左右的培養(yǎng)液，37°C酶反應6d,可轉化富馬酸9kg/L。2000年，王雪根、徐虹等又實現了游離整體細胞法工業(yè)化生產L-天冬氨酸，發(fā)酵培養(yǎng)基:富馬酸銨0.4%，富馬酸鈉2.0%,蛋白胨0.9%，牛肉膏0.4%，玉米漿1.4%,KH2PO40.05%,MgSO4#7H2O0.05%泡敵0.01%;pH7.0~7.5。發(fā)酵工藝：在搖床上培養(yǎng)5-10L種子,接種于800L氣升式發(fā)酵罐。發(fā)酵條件:初始pH6.5-7.0,風量0.6VVM，溫度37C，裝液量500-550L。L-天冬氨酸的生產流程見下圖。游離整體細胞可以在較短的時間內轉化為較多的富馬酸，且轉化較為徹底，轉化率平均在99%以上，有的接近l00%。800L^?tf(氣升式〉 FWC反應踢 產物溶 脫色抽 At t I搖瓶種子 底麟群液 干燥斜瓦神子 反丁烯二酸 成品圖I游離整體細胞法生產L-天冬氮酸的工藝流程2003年北京化工大學唐芳等利用較為便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作為氮源，用葡萄糖部分代替富馬酸作為復合碳源，培養(yǎng)產天冬氨酸酶的大腸桿菌。結果表明，改變培養(yǎng)基配比后，對菌體的總體酶活力(即對底物轉化能力)影響不大，轉化率可達99%以上，通過上罐發(fā)酵初步估算可以節(jié)約培養(yǎng)基碳氮源成本大約60%2.3生物拆分法生物拆分法主要用來合成D-天冬氨酸利用L-Asp-P-脫羧酶進行拆分自然界中含高活性L-Asp-P-脫羧酶的微生物較多。該酶能專一催化L-Asp脫除。位羧基生成L-丙氨酸(L-Ala)，因此可以利用該酶把DL-Asp中的L-Asp轉化成L-Ala，而獲得D-Asp。利用L-Asp-p-脫羧酶進行的拆分是目前研究較為成熟的一種方法。2008年韓銘海等提出了一種利用L-天冬氨酸-P-脫羧酶生物轉化拆分DL-天冬氨酸得到D-天冬氨酸的方法。當牛肉膏濃度為0.2%、玉米漿為1.0%、蛋白胨為1.0%時，發(fā)酵液酶活力可以達到最高。轉化過程最適pH值為6?7,轉化過程最適溫度50C，濃度6.0%以上的丙氨酸能顯著提高轉化過程中酶的熱穩(wěn)定性。利用D-天冬氨酸和L-丙氨酸的等電點的差異來分離提取D-