第九章放射性核酸探針的制備及應(yīng)用

第九章放射性核酸探針的制備及應(yīng)用探針（probe）是指經(jīng)放射性等物質(zhì)標(biāo)記的特定的DNA或RNA序列。利用探針通過核酸雜交可檢測特定的基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在基因克隆、鑒定和分析的許多方面都涉及到利用探針進(jìn)行雜交，例如，鑒定cDNA和基因組DNA文庫，需要用標(biāo)記探針與菌落或噬菌斑雜交；分析目的基因的轉(zhuǎn)錄和加工情況需要用標(biāo)記探針與RNA雜交，定位特定目的基因的位置，需要Southern雜交；構(gòu)建限制酶圖譜也可利用雜交?？傊怂犭s交的使用范圍很廣。因雜交是在目的DNA與放射標(biāo)記探針之間進(jìn)行，故在進(jìn)行利用雜交的分子克隆工作中經(jīng)常需要制備各種核酸探針。核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)可分為DNA和RNA探針；根據(jù)用放射性標(biāo)記物標(biāo)記與否，可分放射性核酸探針和非放射性核酸探針；根據(jù)是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況，可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。一、雙鏈DNA探針

1、切口平移法(Nicktranslation)2、隨機引物合成法

二、單鏈DNA探針

1、從M13載體衍生序列合成DNA探針2、從RNA合成單鏈cDNA探針三、末端標(biāo)記DNA探針

1、3，末端標(biāo)記2、5，末端標(biāo)記

(1)前向反應(yīng)(Forwardreaction)

(2)交換反應(yīng)(Exchangereaction)

四、寡按苷酸探針

1、T4多核苷酸激酶標(biāo)記

2、末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(Altar等，1989)

3、Klenow片段標(biāo)記

五、RNA探針第一節(jié)放射性核酸探針的基本類型與制備方法第二節(jié)放射性核酸探針在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用放射性核素（32P、3H、35S或125I）標(biāo)記的核酸探針，已成為分子生物學(xué)研究的重要工具。它的利用，使得人們能夠從分子水平上直接進(jìn)行遺傳物質(zhì)的檢測（即基因的定位、定量和順序分析）以及重組DNA中目的片段的鑒定。這已成為同位素示蹤技術(shù)的一項新的內(nèi)容。放射性核素探針與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，可以用來鑒別重組子、分離基因、分析DNA片段、研究基因表達(dá)。本節(jié)主要介紹放射性核酸探針在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用，同時介紹有關(guān)分子雜交的部分內(nèi)容。一、分子雜交的基本原理互補的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對而形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程稱為雜交。形成雜交分子的前提是核酸單鏈之間具有一定的互補序列（即有某種同源性）。分子雜交是通過印跡將核酸分子固定在固體支持物上，然后用放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影顯示出目的DNA或RNA分子所處位置。

二、Southern雜交MiddleSouthernblotting：1975年，E.M.Southern利用毛細(xì)作用將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紙上，…….Northernblotting：1977年，Alwine利用毛細(xì)作用將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紙上，…….Westernblotting：1979年，Towbin利用電場作用進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，…….Easternblotting：1982年，Reinhart利用電聚焦作用進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，…….三、放射性核酸探針在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用（1）篩選載體外源DNA需要與某種工具重組，然后才能導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行克隆和保存或表達(dá)外源DNA中的遺傳信息，這種將外源DNA攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具稱為載體。根據(jù)核酸序列的同源性，利用放射性核酸探針與轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞中的質(zhì)?；蚴删w進(jìn)行雜交，可以篩選出重組的質(zhì)?；蚴删w。從而實現(xiàn)重組載體的篩選。（2）檢測基因表達(dá)細(xì)胞核內(nèi)的DNA片段通過轉(zhuǎn)錄形成mRNA并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。被檢測基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄情況可以進(jìn)行如下分析：①Northern雜交檢查細(xì)胞中是否含有特定的mRNA，測定特定mRNA在總RNA中的比例，由此獲得目的mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。②斑點雜交應(yīng)特異性探針檢測mRNA，并估計表達(dá)過程中mRNA的轉(zhuǎn)錄程度。（3）篩選基因文庫由于在構(gòu)建文庫的工作中需要篩選大量的重組子，通常都采用雜交進(jìn)行篩選，以便在較短的時間內(nèi)獲得陽性克隆。用DNA片段作為探針進(jìn)行雜交的溶液主要有：甲酰胺；水溶液。這兩種溶液都能得到良好的結(jié)果。（4）鑒定作物品種由于不同品種的作物，其DNA和mRNA存在著差異，因此用特定的核酸探針進(jìn)行不同品種間的分子雜交，可得到不同品種在遺傳物質(zhì)上的差異。（5）診斷與鑒定病害在病害的診斷和鑒定中，核酸探針技術(shù)被認(rèn)為是一種非常有力的手段。它不僅能確定染色體組的組成和基因的功能，而且為病毒的診