觀察膠原蛋白對成纖維增殖及小鼠傷口愈合的影響,免疫學(xué)論文

觀察膠原蛋白對成纖維增殖及小鼠傷口愈合的影響,免疫學(xué)論文皮膚損傷創(chuàng)面治療是臨床常見問題,如患者伴有免疫功能低下及糖尿病等疾病,傷口通常較難愈合,怎樣促進(jìn)創(chuàng)面愈合并提高愈合質(zhì)量一直是研究的熱門。創(chuàng)傷修復(fù)是由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子介入、且互相作用的復(fù)雜經(jīng)過,膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)重要組成成分可促進(jìn)多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和增殖,并可促進(jìn)生長因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)傷口愈合。Chai等發(fā)現(xiàn),將熒光標(biāo)記的魚鱗膠原蛋白置于小鼠皮膚外表,魚鱗膠原蛋白可透過皮膚角質(zhì)層,并可活化成纖維細(xì)胞,加強(qiáng)皮膚的彈性及保濕性。Castillo-Briceo等研究發(fā)現(xiàn):膠原蛋白中的GFOGER、GLOGEN構(gòu)造域可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的黏附、增殖及IL-1基因的表示出。利用膠原蛋白膠制成的敷料治療糖尿病小鼠皮膚潰瘍,治療第7天,可使傷口縮小62%。當(dāng)前,天然膠原蛋白主要來源于畜類及禽類動(dòng)物組織,但由于瘋牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆發(fā),使陸生哺乳動(dòng)物膠原蛋白的安全性普遍遭到質(zhì)疑。我們國家水產(chǎn)品豐富,在加工魚產(chǎn)品同時(shí)產(chǎn)生大量下腳料,華而不實(shí)魚鱗約占總質(zhì)量5%,通常被當(dāng)作垃圾丟棄,我們國家每年丟棄的魚鱗約有30萬噸。蛋白質(zhì)是魚鱗的主要成分,約占總重的70%,華而不實(shí)主要是膠原蛋白和魚鱗硬蛋白。本室的前期工作表示清楚,水提法提取的魚鱗膠原蛋白可去除氧自由基,提高超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)含量,具有良好的生物學(xué)活性。在這里基礎(chǔ)上,本研究利用水提法提取魚鱗膠原蛋白,觀察膠原蛋白對成纖維增殖及對免疫功能低下小鼠傷口愈合的影響,為魚鱗膠原蛋白開發(fā)利用及損傷修復(fù)治療研究奠定基礎(chǔ)。1、材料與方式方法1.1材料魚鱗取自牡丹江市新瑪特超市(新鮮的各種魚鱗混合物)。BALB/C小鼠,雌雄各半,體重18~20g;3日齡內(nèi)Wsitar乳鼠,由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,ELISA試劑盒為RD公司產(chǎn)品,引物由上海生工生物工程有限公司合成,SYBRPremixExTaqTM為TaKaRa公司產(chǎn)品。1.2方式方法1.2.1魚鱗膠原蛋白膜制備:①魚鱗前處理:新鮮魚鱗清水沖洗烘干1%鹽酸溶液脫鈣清水、蒸餾水沖洗調(diào)pH值烘干,備用。②水提法制備魚鱗膠原蛋白膜:取適量經(jīng)處理魚鱗,搗碎,按1∶30比例參加蒸餾水,100℃水浴30min,80℃水浴1.5h,4℃、8000r/min離心20min,取上清,經(jīng)0.45m濾膜過濾除菌后,于超凈臺(tái)內(nèi)自然枯燥后即得魚鱗膠原蛋白膜。③膠原蛋白含量測定:采用對二甲基氨基苯甲醛比色法測定膠原蛋白特征氨基酸-羥脯氨酸的含量,測得值11.1即為膠原蛋白的量。提取率=提取的膠原蛋白量/魚鱗中總的膠原蛋白量100%。1.2.2魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響:大鼠真皮成纖維細(xì)胞分離:取3日齡內(nèi)的Wsitar乳鼠背部皮膚,參加0.25%中性蛋白酶溶液,4℃酶解消化過夜,分離真皮、表皮。將真皮部分參加0.25%的Ⅰ型膠原酶37℃酶解消化1h。PBS溶液洗滌離心、200目細(xì)胞篩過濾去除基質(zhì)成分,得到的細(xì)胞為大鼠真皮成纖維細(xì)胞。MTT法檢測魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響:取適量無菌膠原蛋白膜,用1640培養(yǎng)液溶解制成濃度為5、10、20、40mg/L液體,與生長狀態(tài)良好的大鼠真皮成纖維細(xì)胞4103個(gè)共同培養(yǎng)于96孔板中,未加膠原蛋白孔為空白對照。培養(yǎng)48h后,每孔參加MTT溶液(5g/L)20L,繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清,每孔參加DMSO溶液150L,振蕩10min,于490nm處檢測吸光度(OD)值。增殖率E(%)按下面公式計(jì)算。E(%)=(A樣品-A0)/A0100%(A0為空白對照組吸光度值;A樣品為膠原蛋白組吸光度值)。1.2.3免疫低下小鼠皮膚損傷模型制備:利用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫低下。將小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg,天天1次,連續(xù)2天,建立小鼠免疫低下模型。隨機(jī)取正常小鼠10只,作為正常組;取免疫低下小鼠40只,隨機(jī)分為4組(模型組、魚鱗膠原蛋白1mg、0.5mg、0.25mg組)。乙醚麻醉,背部去毛,消毒,用特制打孔器在小鼠背部打一直徑為1cm的圓形孔,切除皮膚全層。造模第1天,正常組、模型組傷口處覆蓋無菌紗布,魚鱗膠原蛋白組傷口處覆蓋含量為1mg、0.5mg、0.25mg的魚鱗膠原蛋白膜,每日更換紗布及給藥1次,觀察傷口愈合情況,并將創(chuàng)面描記在半透明紙上,計(jì)算創(chuàng)面面積大小,按下面公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率,創(chuàng)面愈合率(%)=(開場創(chuàng)傷面積-未愈合創(chuàng)面面積)/開場創(chuàng)傷面積。1.2.3.1檢測PDGF、TGFmRNA表示出:皮膚損傷后第5、7、10天切取模型組、魚鱗膠原蛋白1mg組、正常組傷口組織,勻漿器研磨,利用Trizol試劑法提取RNA。取1gRNA利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶法合成cDNA。PCR采用SYBRGreen染料法,PDGF上游引物為5-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3,下游引物為5-TTGGCCACCTTGACGCTGCCG-3。TGF上游引物為5-GCTAATGTTGTTGCCCTCCTAC-3,下游引物為5-GGACTTTGGTGTGTTGAGTGTC-3。PCR反響條件為:50℃,2min,94℃,10min,1循環(huán);94℃,15s,60℃,1min,40循環(huán)。以GADPH為內(nèi)參基因,用2-Ct法處理數(shù)據(jù)。1.2.3.2檢測PDGF、TGF含量:皮膚損傷后第5、7、10天切取模型組、魚鱗膠原蛋白1mg組、正常組傷口組織,加適量生理鹽水將組織搗碎,4℃、7500r/min離心15min,取上清,按講明書ELISA檢測PDGF、TGF含量。1.2.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測傷口處M2型巨噬細(xì)胞含量:皮膚損傷后第10天切取模型組、魚鱗膠原蛋白1mg組、正常組傷口組織,用適量生理鹽水沖洗后,放入含有0.1%膠原酶,300U/mLDNAase的PBS中37℃消化90min,離心取上清,用40%/70%不同密度的淋巴細(xì)胞分層液梯度離心,即可得到巨噬細(xì)胞。將巨噬細(xì)胞與FITC標(biāo)記的抗小鼠F4/80、PE標(biāo)記的抗小鼠CD206抗體4℃共同孵育30min,PBS洗滌后,上機(jī)檢測。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。應(yīng)用SPSS17.0軟件,通過t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以珋xs表示,P0.05為差異有顯著性意義,P0.01為差異具有非常顯著性意義。2、結(jié)果2.1魚鱗膠原蛋白對大鼠真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,魚鱗膠原蛋白無細(xì)胞毒性、具有良好的促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖作用,并呈一定劑量依靠關(guān)系,當(dāng)魚鱗膠原蛋白濃度到達(dá)40mg/L時(shí),增殖率可達(dá)38.65%(圖1)。2.2魚鱗膠原蛋白對傷口愈合率的影響與正常組相比,免疫低下小鼠傷口愈合明顯延遲緩慢,造模第5天,正常組的愈合率到達(dá)25.15%。而免疫低下小鼠的愈合率僅為8.34%。魚鱗膠原蛋白具有良好的組織相容性,無細(xì)胞毒性作用,將魚鱗膠原蛋白膜覆蓋在傷口上,明顯促進(jìn)了免疫低下小鼠傷口愈合。與模型組相比,造模第5天,魚鱗膠原蛋白1mg組即明顯促進(jìn)了傷口愈合,愈合率已達(dá)18.19%(P0.01)。第10天,0.5mg魚鱗膠原蛋白組可明顯促進(jìn)傷口愈合(P0.05),愈合率達(dá)57.37%,1mg魚鱗膠原蛋白組愈合率已接近正常組。第15天,1mg組愈合率已到達(dá)96.34%。魚鱗膠原蛋白0.25mg組促愈合作用無顯著性差異(圖2)。2.3魚鱗膠原蛋白對傷口處PDGFmRNA表示出及合成的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比,造模第5天,魚鱗膠原蛋白1mg治療劑量即可促進(jìn)傷口處PDGFmRNA表示出。造模第10天,PDGFmRNA表示出水平接近正常組(膠原蛋白組PDGFmRNA表示出量是模型組的2.31倍,正常組的表示出量是模型組的2.38倍,圖3)。ELISA檢測結(jié)果(圖4)進(jìn)一步表示清楚魚鱗膠原蛋白可促進(jìn)PDGF蛋白合成。2.4魚鱗膠原蛋白對傷口處TGFmRNA表示出及合成的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比,魚鱗膠原蛋白1mg治療劑量可促進(jìn)傷口處TGFmRNA表示出,造模第10天,TGFmRNA表示出水平接近正常組(膠原蛋白組TGFmRNA表示出量是模型組的2.29倍,正常組的表示出量是模型組的2.38倍,圖5)。ELISA檢測結(jié)果(圖6)進(jìn)一步表示清楚,魚鱗膠原蛋白可通過促進(jìn)TGF表示出及合成,促進(jìn)免疫低下小鼠傷口愈合。2.5魚鱗膠原蛋白對傷口處M2型巨噬細(xì)胞含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比,魚鱗膠原蛋白1mg治療劑量可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向傷口處聚集及向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。造模第10天,魚鱗膠原蛋白組傷口處巨噬細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞含量可達(dá)38.57%,而模型組的含量僅為25.26%(圖7)。3、討論膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)重要組成成分,在損傷修復(fù)經(jīng)過中發(fā)揮重要作用。當(dāng)前,天然膠原蛋白提取的主要方式方法為酸法及酶法,但該提取方式方法時(shí)間長,成本高,且大量腐蝕性物質(zhì)對生產(chǎn)設(shè)備要求較高,不合適大規(guī)模生產(chǎn)。本室前期工作表示清楚:與酸法相比,水提法同樣能夠有效的提取魚鱗膠原蛋白,且提取的膠原蛋白具有良好的去除氧自由基,提高SOD、CAT含量作用。本研究采用水提法提取魚鱗膠原蛋白,觀察對免疫低下小鼠傷口愈合作用。成纖維細(xì)胞是構(gòu)成肉芽組織的主要成分之一,能合成、分泌大量膠原蛋白、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì),為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件,還可分泌PDGF、TGF、FGF等多種細(xì)胞因子,通太多途徑介入修復(fù)經(jīng)過。本研究利用原代培養(yǎng)的大鼠真皮成纖維細(xì)胞,觀察魚鱗膠原蛋白對成纖維細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表示清楚:水提法提取的魚鱗膠原蛋白具有良好的生物相容性,能夠劑量依靠的方式促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,當(dāng)濃度到達(dá)40mg/L時(shí),增殖率可達(dá)38.65%。組織損傷修復(fù)是由多種細(xì)胞、因子介入的復(fù)雜經(jīng)過。PDGF、TGF、FGF等因子可通太多途徑調(diào)控修復(fù)經(jīng)過,促進(jìn)傷口愈合。PDGF是第一個(gè)批準(zhǔn)臨床用于治療皮膚損傷的細(xì)胞因子,Nagai等、Man-dracchia等用Becaplermin(重組人PDGF)治療糖尿病患者的皮膚潰瘍,發(fā)現(xiàn)Becaplermin可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、增殖,促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)傷口愈合。在證實(shí)魚鱗膠原蛋白可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)小鼠皮膚傷口愈合基礎(chǔ)上,觀察膠原蛋白對PDGF、TGFmRNA表示出及蛋白合成的影響。RealtimePCR檢測結(jié)果表示清楚:膠原蛋白1mg治療劑量在治療早期,第5天即可促進(jìn)PDGF、TGFmRNA表示出,表示出量分別為模型組的1.52倍、1.34倍。治療第10天,表示出量已接近正常組。ELISA檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):膠原蛋白可促進(jìn)傷口處PDGF、TGF蛋白合成。因而,魚鱗膠原蛋白可通過促進(jìn)傷口處PDGF、TGFmRNA表示出及蛋白合成,促進(jìn)傷口愈合。巨噬細(xì)胞在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞功能具有可塑性及多樣性,隨微環(huán)境變化發(fā)生極化進(jìn)而表現(xiàn)出不同的巨噬細(xì)胞亞型。M2型巨噬細(xì)胞可大量分泌