發(fā)酵種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

第四章種子的擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求種子制備實(shí)例種子制備的技術(shù)概要第一頁(yè)，共36頁(yè)。種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍枯燥管中處休眠狀態(tài)的消費(fèi)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第一節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念:第二頁(yè)，共36頁(yè)。種子擴(kuò)培的目的

接種量的需要

菌種的馴化縮短發(fā)酵時(shí)間、保證消費(fèi)程度種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，可以迅速生長(zhǎng)

無(wú)雜菌污染第三頁(yè)，共36頁(yè)。第一節(jié)種子制備過(guò)程舉例一、谷氨酸消費(fèi)的種子制備制備過(guò)程斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵第四頁(yè)，共36頁(yè)。1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉

瓊脂2%，培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：32℃，生長(zhǎng)18-24小時(shí)生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)

3次第五頁(yè)，共36頁(yè)。2.一級(jí)種子〔搖瓶〕培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%，硫酸鎂培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基一級(jí)種子質(zhì)量要求種齡：12hpH值：6.4±0.1光密度：凈增OD值以上殘?zhí)牵海ヒ韵聼o(wú)菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長(zhǎng)均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽(yáng)性反響第六頁(yè)，共36頁(yè)。3.二級(jí)種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)〔容積為發(fā)酵罐的1%〕，32℃培養(yǎng)7-10個(gè)小時(shí)培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基通風(fēng)量:50L種子罐1:0.5,攪拌轉(zhuǎn)速340r／min；

250L種子罐1:0.3,攪拌轉(zhuǎn)速300r／min500L種子罐1:0.25,攪拌轉(zhuǎn)速230r／min第七頁(yè)，共36頁(yè)。種子的質(zhì)量要求：108-109個(gè)/ml大小均勻，呈單個(gè)或八字排列時(shí)完畢，活力旺盛無(wú)菌檢查第八頁(yè)，共36頁(yè)。二、青霉素消費(fèi)的種子制備制備過(guò)程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級(jí)種子→二級(jí)種子→發(fā)酵第九頁(yè)，共36頁(yè)。1、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于長(zhǎng)孢子，用量少而精細(xì)培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右第十頁(yè)，共36頁(yè)。2、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源〔玉米漿〕培養(yǎng)基的特點(diǎn)：本錢低、米粒之間構(gòu)造疏松進(jìn)步比外表積和氧的傳質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)適當(dāng)〔要求大米的白點(diǎn)小〕有利于孢子的生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個(gè)孢子第十一頁(yè)，共36頁(yè)。3、一級(jí)種子培養(yǎng)基：〔葡萄糖、乳糖、蔗糖〕、玉米漿目的：長(zhǎng)菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時(shí)接種量：200億孢子/噸4、二級(jí)種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時(shí)接種量：10%第十二頁(yè)，共36頁(yè)。三、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大倍數(shù)：第1級(jí)到第2級(jí)為8-10倍第2級(jí)到第3級(jí)為4-6倍1，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)第十三頁(yè)，共36頁(yè)。2，車間擴(kuò)大培養(yǎng)第十四頁(yè)，共36頁(yè)。從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器接種接種方式：從種子罐接種：第十五頁(yè)，共36頁(yè)。種子的質(zhì)量要求菌絲長(zhǎng)稠呈絲狀、菌絲團(tuán)很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長(zhǎng)共分為6個(gè)期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的才能最強(qiáng)第十六頁(yè)，共36頁(yè)。第二節(jié)種子制備的技術(shù)概要一、種子制備的過(guò)程實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過(guò)程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過(guò)程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。消費(fèi)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)展，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過(guò)程為消費(fèi)車間階段。第十七頁(yè)，共36頁(yè)。二、實(shí)驗(yàn)室階段1、培養(yǎng)物選擇的原那么目的：種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點(diǎn)最終的培養(yǎng)物可分為兩類：

對(duì)于不產(chǎn)孢子和芽胞的微生物

——獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體對(duì)于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實(shí)驗(yàn)室階段的種子擴(kuò)培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。第十八頁(yè)，共36頁(yè)。

獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因此更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。

對(duì)于產(chǎn)孢子的微生物

獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。第十九頁(yè)，共36頁(yè)。例：放線菌孢子的制備采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無(wú)機(jī)鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28?C。培養(yǎng)時(shí)間為5~14天。第二十頁(yè)，共36頁(yè)。2，厭氧培養(yǎng)：對(duì)于酵母菌〔啤酒，葡萄酒，清酒等〕試管→三角瓶→卡式罐→種子罐對(duì)于產(chǎn)孢子才能不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。試管→三角瓶→搖床→種子罐第二十一頁(yè)，共36頁(yè)。2、培養(yǎng)基選擇的原那么培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì)孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長(zhǎng)。在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。第二十二頁(yè)，共36頁(yè)。3、起始接種物的傳代問(wèn)題

細(xì)菌保藏斜面→活化斜面

產(chǎn)孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。第二十三頁(yè)，共36頁(yè)。

母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長(zhǎng)，并去處變異株。所以接種時(shí)要稀一點(diǎn)、便于純化生長(zhǎng)到單菌落。

子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接種：①?gòu)哪感泵嫔宵c(diǎn)接種，選取生長(zhǎng)好的單菌落②接種時(shí)密一點(diǎn)，得到大量的孢子。孢子培養(yǎng)時(shí)注意濕度，子斜面使用一般不超過(guò)1個(gè)月孢子培養(yǎng)第二十四頁(yè)，共36頁(yè)。三、消費(fèi)車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原那么在消費(fèi)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。

縮短發(fā)酵時(shí)間

有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：第二十五頁(yè)，共36頁(yè)。2、培養(yǎng)基選擇的原那么目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所以營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是根本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個(gè)方面的原因:

一是本錢二是馴化第二十六頁(yè)，共36頁(yè)。例：檸檬酸發(fā)酵

以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%第二十七頁(yè)，共36頁(yè)。

薯干粉成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%瓊脂2%第二十八頁(yè)，共36頁(yè)。3、發(fā)酵級(jí)數(shù)確實(shí)定谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子〔搖瓶〕→二級(jí)種子〔小罐〕→發(fā)酵青霉素：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子〔小罐〕→二級(jí)種子〔中罐〕→發(fā)酵一般由菌絲體培養(yǎng)開(kāi)場(chǎng)計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐開(kāi)場(chǎng)計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)第二十九頁(yè)，共36頁(yè)。發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的根據(jù)

級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響

級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反響級(jí)數(shù)確實(shí)定是非常重要的一個(gè)方面第三十頁(yè)，共36頁(yè)。細(xì)菌：二級(jí)發(fā)酵茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵孢子懸浮液→一級(jí)種子罐〔27?C,40小時(shí)孢子發(fā)芽〕→二級(jí)種子罐〔27?C,10~24小時(shí)〕→發(fā)酵罐放線菌：四級(jí)發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子常用微生物發(fā)酵級(jí)數(shù)：第三十一頁(yè)，共36頁(yè)。4、接種量確實(shí)定

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積過(guò)大過(guò)小都不好，以理論定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。通常接種量：細(xì)菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時(shí)20~25%雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。第三十二頁(yè)，共36頁(yè)。5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)場(chǎng)移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長(zhǎng)：易老化。原那么：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。嗜堿性芽孢桿菌消費(fèi)堿性蛋白酶，12小時(shí)最好。第三十三頁(yè)，共36頁(yè)。6、種子的質(zhì)量要求：量：要求到達(dá)一定的濃度質(zhì):形態(tài)〔生長(zhǎng)處于某個(gè)階段、均勻等等〕理化指標(biāo)：C、N、P的含量，pH，產(chǎn)物生成量