Chapter20高效液相色譜法

Chapter20HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)化學化工學院楊睿第一部分概述第二部分高效液相色譜儀第三部分HPLC的主要類型及色譜分離方法的選擇高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)：用高壓力輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段的液相色譜法。§20－1概述柱前壓：50～500105Pa；

填充粒徑：5～10mm；1～3mmn：5～6104

；1～3105

一、HPLC的特點：1.與經(jīng)典液相色譜法比較固定相、輸液設備、檢測手段2.與氣相色譜法比較分析對象、流動相、操作條件GC：：氣體、20%的有機物（低級烴、石油化工）HPLC：80%的有機物；

蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、藥物、藥用植物有效成分、高聚物、染料。。。

固定相粒徑理論塔板數(shù)LC：100~200mm

<3000HPLC：<10mm5~30萬3.HPLC的特點：分離效能高（n=104m-1，柱效?

一般LC）選擇性高

檢測靈敏度高分析速度快

重現(xiàn)性好應用范圍廣（可分析80%有機化合物）局限性：缺乏通用檢測器；設備費用昂貴；操作嚴格二、HPLC的分類：（按分離機制）體積排阻色譜吸附色譜分配色譜離子交換色譜msmsms-+ms三、正、反相色譜體系流動相是非極性,固定相是極性的流動相極性<

固定相極性正相色譜：流動相是極性,固定相是非極性的流動相極性>固定相極性反相色譜：正己烷<乙醚<乙酸乙酯<

異丙醇水>甲醇>乙腈>四氫呋喃正相色譜反相色譜固定相硅膠(表面修飾)、氧化鋁非極性烷基健合固定相流動相極性比固定相弱極性比固定相強保留值隨試樣極性↑而隨流動相極性↑而隨試樣極性↑而隨流動相極性↑而適用對象異構體（對映異構、空間異構）；中等極性或極性化合物；同系物；非極性或低極性化合物操作溫度室溫最高50~800C(以降低黏度)

↑↓↓

↑相對分子質量102103104105106吸附色譜正相分配色譜體積排阻色譜離子交換色譜分配色譜反相分配色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜極性增加§20－2高效液相色譜儀高效液相色譜儀流程圖貯液瓶高壓輸液泵進樣器色譜柱檢測器記錄裝置預柱梯度洗脫裝置恒流泵恒壓泵溶質型檢測器總體檢測器防止不溶性顆粒堵塞避免強保留組分污染光電二極管陣列2011SpringSemester1、HPLC的固定相按承受高壓能力分類:剛性固體：以SiO2為基質（可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓）在SiO2表面鍵合各種官能團，可擴大應用范圍，是目前最廣泛使用的一種固定相硬膠：由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成（3.5×108Pa）主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中§20－3HPLC的固定相和流動相按孔隙深度分類:表面多孔型：基體為實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料（如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等），常用做保護柱填料全多孔型：由直徑為10nm的硅膠微粒，或氧化鋁微粒凝聚而。顆粒很細（5～10μm），傳質速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析。2、HPLC的流動相(1).HPLC對流動相的基本要求：(2).與分離有關的溶劑性質：溶劑強度°：溶劑對固定相的親和力溶解度參數(shù)d：衡量溶劑對化合物的洗脫能力極性參數(shù)P’

：衡量溶劑極性大小流動相溶劑強度°(SiO2)極性指數(shù)P’環(huán)己烷0.030.04n-正己烷0.010.1四氯化碳0.111.6甲苯0.222.4乙醚0.382.8二氯甲烷0.343.1四氫呋喃0.354.0氯仿0.264.1乙醇0.684.3乙酸乙酯0.384.4二氧六環(huán)0.494.8甲醇0.735.1乙腈0.505.8水強10.2HPLC常用流動相的性質P’越大，溶劑極性越大（極性洗脫）正相色譜：反相色譜：°越大，溶劑與固定相親和力越強，越容易將樣品從固定相上洗脫（強度洗脫）純?nèi)軇┑臉O性和保留值的關系：實驗表明，當流動相的P’

改變2個單位時，k’值大約變化10倍：正相色譜反相色譜混合溶劑的極性：§20－4液固（吸附）色譜法(LSC)

Liquid–SolidAdsorptionChromatography分離原理固定相流動相應用實例§20－5液液（分配）色譜法(LLC)

Liquid–LiquidPartitioningChromatography分離原理固定相流動相應用實例由于固定相易流失，已逐漸為化學鍵合相色譜法和不要載體的逆流色譜法代替§20－6化學鍵合相色譜法(CBSPC)

BondedStationaryPhasesChromatography化學鍵合固定相法反相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法離子性鍵合相色譜法手性色譜法采用化學鍵合固定相進行分離的液相色譜§20－7排阻色譜法大分子物質的分離測定聚合物分子量及其分布主要用途：（自學）其他的HPLC法§20－8色譜分離方法的選擇選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是試樣的相對分子質量的大小、在水中和有機溶劑中的溶解度、極性和穩(wěn)定程度以及化學結構等物理性質和化學性質色譜體系的選擇普通樣品的定性定量分析任務排阻色譜高分子量樣品水溶性反相排阻油溶性正相排阻特異性生物物質親和色譜水溶性樣品反相色譜油溶性樣品正相色譜保證樣品在流動相中有良好溶解度不離解分子型鍵合色譜離子型離子交換色譜離子對色譜可離解或可形成離子液相色譜中等分子量非揮發(fā)性樣品氣相色譜低分子量氣體(在液體中溶解度小、k’太小)低分子量氣固色譜氣液色譜300℃以下?lián)]發(fā)性樣品色譜體系的選擇對樣品進行快速、高分辨的分析任務定量分析為主優(yōu)先采用液相色譜定性分析為主優(yōu)先采用毛細管電泳離子型化合物區(qū)帶電泳DNA/核苷酸等大蛋白質凝膠色譜與凝膠電泳含強疏水基團電色譜非離子、傾向疏水化合物離子膠束電動色譜低濃度生物質濃縮等速電泳兩性生物質等電聚焦電泳手性異構體拆分手性毛細管電泳HPLC的應用

1.環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測器：差示折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器化學鍵合固定相法優(yōu)勢：鍵合相非常穩(wěn)定，適用于梯度洗脫由于鍵合到載體表面的官能團可以是不同極性的，因此適用于種類繁多樣品的分離表面吸附和催化作用小，少數(shù)幾種鍵合相可以滿足大部分化合物的分離分析要求，目前約80%的分離分析是用鍵合相色譜完成的鍵合固定相類型：用來制備鍵合固定相的載體，主要是硅膠，利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機分子反應成鍵,得到各種性能的固定相。一般可分三類：疏水基團：如不同鏈長的烷烴(C2,4,8,18等)、苯基等非極性鍵合相——反相鍵合相色譜極性基團：如氨基、氰基、二醇基等極性鍵合相——正相鍵合相色譜離子交換基團：如作為陰離子交換基團的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團的磺酸等離子交換鍵合相——離子交換色譜有機基團與基體硅膠表面的鍵型有四類：1.Si-O-C型(硅酸酯型)，酯化反應得到，易水解和醇解，只在正相色譜中使用由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質特性，這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的低極性流動相，分離極性化合物2.Si-N型（共價鍵鍵合型），氯化硅膠與胺進行胺化反應制備，未商品化共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是當使用水溶液時，必須限制pH在4～8范圍內(nèi)3.Si-O-C型（共價鍵健合型），氯化硅膠與格氏試劑反應得到，穩(wěn)定性好共價鍵健合固定相不易水解，熱穩(wěn)定性好。缺點是格氏反應不方便，制備復雜、成本高例：4.Si-O-Si-C型（硅烷化鍵合固定相），通過硅醇基與硅烷化試劑反應制備，制備簡單這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點，在70℃以下，pH=2～9范圍內(nèi)正常工作，應用最為廣泛流動相：強極性溶劑（甲醇，乙腈，四氫呋喃等）用水調(diào)節(jié)洗脫強度極性大的組分保留時間短極性小的組分保留時間長反相鍵合相色譜：流動相極性>

固定相極性流動相：弱極性溶劑（乙醚，二氯甲烷，氯仿等）用正己烷調(diào)節(jié)洗脫強度極性小的組分保留時間短極性大的組分保留時間長正相鍵合相色譜：流動相極性<

固定相極性離子性鍵合相色譜：40手性固定相（CSP）色譜：常見的CSP：

給體-受體CSP；

多糖類CSP；

環(huán)糊精CSP；

蛋白質CSP；

其它的CSP分離原理分離前提：K

或k‘

差異根據(jù)各組分在固定相表面上吸附能力的差異實現(xiàn)分離固體固定相溶劑°越大，洗脫能力越強，越容易將樣品從固定相上洗脫，保留時間越短極性固定相LSC固定相（粒徑5~10mm）非極性固定相酸性吸附劑：硅膠、硅酸鎂用于分離堿性物質堿性吸附劑：氧化鋁、氧化鎂、聚酰胺用于分離酸性物質活性炭、炭黑、高分子多孔小球用于分離弱極性化合物LSC流動相極性（硅膠，氧化鋁等）流動相選擇的依據(jù)是待測樣品極性的大小固定相流動相以非極性流動相為主體，加入中－強極性溶劑為改性劑，以調(diào)節(jié)洗脫強度待測樣品極性非極性（高分子聚合物，活性炭等）以極性流動相為主體，加入中－弱極性溶劑為改性劑，以調(diào)節(jié)洗脫強度非極性梯度洗脫一般地，含弱吸附與部分中等吸附官能團組分的分離，可以用烴類作洗脫液含羰基化合物，用二氯甲烷作洗脫液其余組分的分離，則在洗脫液中添加乙腈或甲醇液固吸附色譜優(yōu)勢：分離難溶于水的非極性化合物、位置異構體、立體異構體等液固吸附色譜中的保留時間通常為：飽和烴<烯烴<芳香烴<鹵代物和硫化物<醚<硝基化合物<酯≈醇≈胺<砜<亞砜<酰胺<羧酸表面多孔型顆粒ALLC固定相30mm實心球1～2mm5mm全多孔型粒子B全多孔型顆粒C深孔載體固定液幾種不同極性的固定液物理作用LLC流動相流動相極性<固定相極性正相色譜：液-液色譜：要求流動相對固定相的溶解度盡可能小，使用前要彼此飽和流動相極性>固定相極性反相色譜：固定液易流失，不適用于梯度洗脫化學鍵合固定相法優(yōu)勢：鍵合相非常穩(wěn)定，適用于梯度洗脫由于鍵合到載體表面的官能團可以是不同極性的，因此適用于種類繁多樣品的分離表面吸附和催化作用小，少數(shù)幾種鍵合相可以滿足大部分化合物的分離分析要求，目前約80%的分離分析是用鍵合相色譜完成的鍵合固定相類型：用來制備鍵合固定相的載體，主要是硅膠，利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機分子反應成鍵,得到各種性能的固定相。一般可分三類：疏水基團：如不同鏈長的烷烴（C8和C18）、苯基等非極性鍵合相——反相鍵合相色譜極性基團：如氨丙基、氰基、醇等極性鍵合相——正相鍵合相色譜離子交換基團：如作為陰離子交換基團的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團的磺酸等離子交換鍵合相——離子交換色譜有機基團與基體硅膠表面的鍵型有四類：1.Si-O-C型(硅酸酯型)，酯化反應得到，易水解和醇解，只在正相色譜中使用由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質特性，這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的低極性流動相，分離極性化合物2.Si-N型（共價鍵鍵合型），氯化硅膠與胺進行胺化反應制備，未商品化共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是當使用水溶液時，必須限制pH在4～8范圍內(nèi)3.Si-C型（共價鍵健合型），氯化硅膠與格氏試劑反應得到，穩(wěn)定性好共價鍵健合固定相不易水解，熱穩(wěn)定性好。缺點是格氏反應不方便，制備復雜、成本高例：4.Si-O-Si-C型（硅烷化鍵合固定相），通過硅醇基與硅烷化試劑反應制備，制備簡單這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點，在70℃以下，pH=2～9范圍內(nèi)正常工作，應用最為廣泛實驗室自裝柱：細粒度的填料（＜20mm）一般采用勻漿填充法裝柱商品柱梯度淋洗裝置溶劑A

混合室高壓泵1高壓泵2

程序控制器色譜柱計量泵(低壓)溶劑A溶劑B混合室高壓泵色譜柱溶劑B等梯度洗脫裝置

兩種典型的光化學流動池流動相入口流動相入口流動相出口